Рестрикція геномної ДНК на фрагменти і клонування фрагментів за допомогою різних векторів створили основу формування геномних бібліотек.
Конструювання геномних бібліотек значить конструювання тих фрагментів ДНК. що використовуються для секвенування. Існує 2 варіанти конструювання цих бібліотек:
· In Vivo -й методик I покоління, ПЕРЕВАГИ: бібліотеки створені in vivo можна використовувати і для ін. Речей. наприклад в картировании геномів
Відносять ієрархічний підхід
· In vitro -й методик II покоління, зручніше використовувати
Відносять шотган -підхід
Геномна бібліотека. Якщо геном будь-якого організму розрізати, вставити в плазмідні або вірусні вектора і ввести в клітину, то в такому вигляді його можна зберегти. При розрізуванні плазмидной або фагової ДНК ймовірність випадання цілих і незмінених шматків генома досить висока.
Такий спосіб отримання геномної бібліотеки отримав назву «метод дробовика», так як геном в даному випадку представлений окремими фрагментами.
Принципи створення плазмідних та вірусних векторів загальні, тому розглянемо їх на прикладі плазмідних. Слід зазначити, що з вірусних ДНК краще використовувати ДНК фагів, так як вони мають велику ємність і дозволяють вставляти більші шматки генома.
Очищені кільцеві молекули ДНК обробляють рестриктазой, отримуючи лінійну ДНК. Клітинну ДНК обробляють тієї ж рестриктазой, додають до плазмидной, додають лігази. Таким чином отримують рекомбинантную плазмидную ДНК, яку вводять в бактеріальні або дріжджові клітини. Плазмида реплицируется з утворенням багатьох копій. Багато плазміди несуть ген стійкості до антибіотиків, і якщо в рекомбінантної плазміди є такий ген, то клітини легко виявляти, вирощуючи на середовищі з антибіотиком.
Кожна така колонія являє собою клон або потомство однієї клітини. Плазміди однієї колонії містять клон геномної ДНК, а сукупність плазмід можна назвати бібліотекою геномної ДНК. Недолік такого методу в тому, що фрагменти ДНК утворюються у величезній кількості. Розрізання геномної ДНК визначається випадком, тому лише частина фрагментів містять повноцінні гени. Деякі фрагменти можуть містити тільки частина гена або ж Інтрони послідовності.
Бібліотека кДНК. Створення кДНК починається з синтезу на матриці РНК за допомогою зворотної транскриптази комплементарної нитки ДНК. Потім створюють лужні умови, руйнують ланцюг РНК на нуклеотиди, після чого за допомогою ДНК-полімерази синтезують комплементарних ланцюг ДНК. При цьому утворюється фрагмент ДНК з тупими кінцями. Таку ДНК вбудовують в плазміди і вводять в клітини бактерій. При ампліфікації плазміди утворюється клон комплементарної копії ДНК (кДНК).
Переваги клоновій ДНК перед клонами геномної ДНК в тому, що кодує білок нуклеотидних послідовність гена нічим не переривається.
Гени еукаріот містять інтрони, які повинні вилучатися з транскріптной РНК перед перетворенням її в матричну, після чого слід сплайсинг (зрощення). Бактеріальні клітини не можуть здійснювати таку модифікацію РНК, що утворилася шляхом транскрипції гена еукаріотичної клітини. Тому якщо переслідують отримання білка шляхом експресії клонованого гена, то краще використовувати банк кДНК, отриманої на основі матричної РНК.
Вектори - пристосовані для клонування чужорідних фрагментів ДНК молекули, що мають в своєму складі:
1. Точку початку реплікації (Ori)
2. селективний маркер (ген антибіотикорезистентності)
3. Рестрекціонние сайти, зручні для клонування.
Також до складу векторів можуть входити:
· Гени, які контролюють распреділеніі копій вектора мужду дочірніми клітинами (для нізкокопійних векторів)
· Теломерной послідовності (для лінійних векторів)
Вектори, які використовуються в геномних проектах
2. Фагові вектори
4. Штучні хромосоми
Плазміди. рUC. 90% сіквенсів робиться на цій плазмиде. У дуже рідкісних випадках береться якийсь інший вектор, але такого ж типу - невелика висококопійная бактеріальна плазмида. Використовується вона, тому що це висококопійная плазмида, присутній в клітці до 1000 копій, її легко виділити і концентрація її в препараті висока, тому легко очищати. Виходить ДНК високої якості, .... Технологічно такий вектор забезпечує найвищу якість сиквенсу, тому основна маса секвенування робиться на таких плазмидах. До того ж процес з використанням висококопійной плазміди легко роботизировать. Недоліки, пов'язані з високою копийности:
Деякі фрагменти геномної ДНК в принципі неможливо клонувати в таких плазмидах, тому що навіть нормальний клітинний ген, якщо число його копій багаторазово зростає, може виявитися токсичним для клітини. Еукаріотичні гени теж можуть бути токсичними для бактеріальної клітини. 5-10% геному в такому векторі клонувати не можна через проблеми токсичності.
У такі вектори можна клонувати протяжні фрагменти ДНК завдовжки більше декількох т.н.п. Коли в pUC робляться вставки по 20-30 т.н.п. плазміди стають нестабільними, тому що копийность у плазміди та ж сама, близько 50% ДНК у клітині може виявитися плазмидной. Виникає потужне селективне тиск, щоб зменшити кількість ДНК. Постійно йдуть процеси рекомбінації, досить легко може відбуватися реорганізація, в першу чергу делеции і інверсії. Будь-яка перебудова плазміди в сторону зменшення буде підхоплена природним відбором. Щодо стабільними виявляються вставки розміром не більше 1,5-2 т.н.п.
Фагові вектори. У них завжди більше ємність: якщо инсерционно вектор, ємність близько 10? т.н.п. якщо вектор заміщення фага лямбда - 20? т.н.п. До того ж при розмноженні бактеріофага не стоїть питання токсичності, тому що при розмноженні фага клітина гине в будь-якому випадку, а фаг реплицировать і упакувати свою ДНК встигне. Це єдина причина, по якій фагів вектори до сих пір використовуються в геномних проектах. За винятком дуже екзотичних ситуацій у клонованих в фагів векторі генів немає шансу стати на заваді розмноженню фага, і якщо вибирати правильні штами фагів, то проблем з перебудовами менше. Вважається, що фагів вектори заміщення досить стабільні, і їх досі використовують у великих геномних проектах, коли потрібно закрити прогалини, які ніяк не клонуються в інших бібліотеках. Недоліки: ДНК фага виділяти набагато менш зручно (складніше методика, набагато більш трудомістке, автоматизувати складніше). Тому фагів вектори зазвичай використовуються на стадії финиширования, коли потрібно закрити прогалини.
Космідний вектор. Це гібрид плазміди і бактеріофага. Картинка неправильна: має бути 2 cos-сайту. До початку 90-х це були вектори з максимальною ємністю (збільшена в порівнянні з бактериофагом в 2 рази). Розмір косміди: 53 т.н.п. (Максимум, який поміщається в головку фага лямбда) мінус розмір самого вектора - це 45-51 т.н.п. ємності. Нормальна косміди несе 2 cos-сайту, тому що фаг нормально пакує в головку лінійну ДНК між двома cos-сайтами. Приготування космідной бібліотеки - набагато більш трудомістка методика, але такі бібліотеки вважаються бібліотеками хорошої якості, оскільки якщо отриманий високий титр фагів частинок, то ДНК не треба реампліфіціровать, бібліотека стабільна і довго зберігається. У будь-який момент можна інфікувати такими косміди бактеріальні клітини і отримати відповідні гени.
Дріжджові штучні хромосоми. Ці вектори спеціально розроблені під проект «Геном людини». Ця програма офіційно стартувала в кінці 90-х. Перша стадія проекту полягала в розробці векторів. Спеціально під проект розроблялися вектори з максимальною ємністю, яку можна було уявити, на основі механізму сегрегації і реплікації дріжджових хромосом. Вони були розроблені, на них були побудовані бібліотеки. Ємність стандартного дріжджового вектора - близько 600 т.н.п. а мега-YAC - 1.4 мільярда. Тобто можна отримати 6-7 тис. клонів, і це буде весь геном людини. Попрацювали з ними років 5, отримали бібліотеки, і десь в середині 90-х з'ясувалося, що ці дріжджові клони з великими вставками дуже нестабільні. ДНК погано зберігається, її потрібно підтримувати в дріжджах, а тоді виникає та ж ситуація, що і з великими вставками в плазмидах бактерій, тільки в набагато більш суворому варіанті: множинні внутрішні реорганізації, делеции, транслокації і т.д. З таким трудом прокартірованнние бібліотеки, прив'язані до фізичних картах, виявилися ні на що не придатними, оскільки це вже не та ДНК, яка була в вихідному геномі людини.