Бібліотеки в молекулярній генетиці. Що таке бібліотека?
Бібліотека - набір клонів, кожен з яких містить векторну молекулу різних фрагментів ДНК, похідних від загальної ДНК або РНК клітин або тканини. Якщо колекція клонів досить велика, теоретично вона повинна містити всю послідовність оригінальної ДНК. Потім можна ідентифікувати в бібліотеці клон, що несе потрібний фрагмент ДНК, використовуючи чутливі скринінгові методи, здатні виявити його в колекції з мільйонів різних фрагментів, званої «бібліотекою».
Геномні бібліотеки. Один корисний тип бібліотек містить набір фрагментів геномної ДНК. генерується за допомогою навмисне обмеженої кількості рестріктази, розрізає ДНК в точках, часто зустрічаються в геномі. Внаслідок використання малої кількості ферменту випадковим чином розщеплюються не всі, а тільки деякі сайти розпізнавання ферменту.
Метод генерує набір перекриваються фрагментів. придатних для клонування в вектори. Наприклад, плазміди, спеціально розроблені для створення ВАС, готують так, щоб в вектор могли бути перенесені згенеровані при частковій рестрикції фрагменти ДНК людини розміром від 100 до 350 кілобаз. Після того як рекомбінантні плазміди, що містять великі фрагменти ДНК людини, внесли в бактерії, бібліотека, яка містить багато тисяч клонів, кожен з яких містить різні фрагменти, частково перекривають геномної ДНК, може зберігатися для подальшого виділення багатьох генів. Якщо бібліотека досить велика, кожен сегмент генома буде представлений принаймні на одному з перекриваються фрагментів.
Бібліотеки комплементарної ДНК. Інший поширений тип бібліотек, який використовується для виділення послідовностей генів, - бібліотеки кДНК, що містять ДНК-копії мРНК конкретної тканини. Як джерело клонування генів для деяких додатків комплементарні послідовності ДНК краще геномних бібліотек, оскільки:
• кДНК містить тільки екзонів гена і, отже, пряме уявлення, що кодує гена без інтронів і промотора;
• комплекти кДНК. що представляють копії одного гена, можуть відрізнятися, що вказує на наявність альтернативних промоторів, або точок поліаденілювання, або різних точок сплайсингу, так що деякі екзонів можуть або включатися, або виключатися з деяких копій;
• використання конкретного джерела мРНК в значній мірі збільшує число копій відомого гена, вибірково експресуватися в цій тканини.
Наприклад, кілька кілобаз ДНК. містять бета-глобінових ген, представляють лише одну мільйонну частину геномної бібліотеки людини, однак це головний мРНК транскрипт в еритроїдних клітинах. Таким чином, бібліотеки кДНК, створені з попередників еритроцитів - оптимальне джерело виділення кДНК, що відповідає мРНК (3-глобіну.
Аналогічно бібліотеки кДНК печінки або м'язів - кращий джерело кДНК клонів генів, експресуються переважно або виключно в цих тканинах. У той же час кДНК не дає ніяких вказівок на розмір або число екзонів гена або послідовність сплайсингу.
Клонування кДНК відбувається за участю ферменту зворотної транскриптази - РНК-залежною ДНК-полімерази, отриманої з ретровірусів, здатних синтезувати однонитевой фрагмент кДНК на основі РНК-шаблону. Отримана одинична нитка кДНК служить шаблоном для ДНК-полімерази, перетворюючої однонитевую молекулу в двухнітевая спіраль. Її використовують в потрібному векторі для створення бібліотеки кДНК, що представляє всі вихідні копії мРНК, виявлені в початковому типі клітин або тканини. кДНК, що представляє конкретну мРНК у всій її повноті, особливо корисна, коли потрібно представити повну довжину послідовності, що кодує гена.
Деякі складно влаштовані вектори. так звані вектори експресії, містять транскрипційні і трансляційні сигнали, приєднані до точки вставки кДНК таким чином, що повна кДНК може бути транскрибувати і оттранслировать бактеріями, дріжджами або культивованими клітинами, виробляючи кодується білок.
Створено тисячі бібліотек кДНК з різних тканин або з одних і тих же тканин, узятих на різних стадіях розвитку багатьох організмів. Вони стали безцінним джерелом кДНК для великого масиву копій мРНК. Отримання великої бібліотеки збільшує шанси того, що будь-яка інформація, що цікавить мРНК, незалежно від того, наскільки вона рідкісна, буде, по крайней мере, один раз представлена в бібліотеці.
Ресурси бази даних геному бібліотек
Хоча побудова бібліотек і їх скринінг залишаються важливими методами для виявлення і опису властивостей генів, проект «Геном людини» і безліч його додатків мають значний вплив на дослідження генетики людини. Наприклад, швидке розширення доступних через Інтернет баз даних, що містять інформацію про нуклеотидних послідовності генів, робить все більш необов'язковим побудова і скринінг бібліотек.
ВАС або до ДНК клони з конкретної цікавить послідовністю нуклеотидів можуть бути ідентифіковані за допомогою програмного забезпечення, яке зіставляє шукану послідовність з усіма завантаженими в бази даних послідовностями. Багато актуальні бібліотеки, що містять упорядковані послідовності окремих клонів, зберігаються в централізованих комерційних сховищах, з яких легко можна отримати будь-який клон з цікавить послідовністю, знайдений автоматизованим пошуком по базі даних.