II. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 7
2.1. Таксономічне положення, поширення та біологічні властивості Staphylococcus hyicus 7
2.2. Роль Staphylococcus hyicus в патології сільськогосподарських тварин і птахів 23
2.3. ПЛР - метод як спосіб ідентифікації Staphylococcus hyicus.
III. ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ 33
3.1. Матеріали і методи досліджень 33
3.2. Виділення Staphylococcus hyicus з різних джерел 58
3.3. Біологічні властивості виділених культур Staphylococcus hyicus 60
3.3.1. Морфологічні та культурально - біохімічні властивості Staphylococcus hyicus 60
3.3.2. Вивчення факторів патогенності Staphylococcus hyicus 64
3.3.3. Дослідження патогенності Staphylococcus hyicus для поросят і лабораторних тварин 69
3.3.4. Чутливість культур Staphylococcus hyicus до антимікробних препаратів 76
3.4. Результати полімеразної ланцюгової реакції при розробці
методу ідентифікації S. hyicus по виявленню гена sodA видо-
спіціфічной супероксиддисмутази 78
IV. ОБГОВОРЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ 84
VI. ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ 96
VII. Список використаної літератури 97
Введення до роботи
Актуальність теми. В даний час підвищення ефективності свинарства стримується наявністю інфекційних хвороб, багато з яких є ще недостатньо вивченими.
В Європі ексудативний епідерміт свиней ще в 60 - 70 - х рр минулого століття приводив до досить великих економічних втрат в свинарстві (Е. Sieverding, 1988), хоча і сьогодні проблема все ще є не вирішеною.
Збудником хвороби є Staphylococcus hyicus, який вперше був виділений, описаний і названий D. Sompolynsky в 1953 році як Micrococcus epidermidis, а в кінці 70-х років минулого століття став офіційно визнаним окремим видом сімейства стафілококів (L. Devriese et al. 1978).
Комплексне вивчення біологічних властивостей стафілококів і продукуються ними біологічно активних речовин лежить в основі уявлення про патогенез спричинених ними захворювань і є базою, на якій в подальшому будується діагностика і розробляються схеми профілактики та терапії.
У нашій країні дослідження біологічних властивостей Staphylococcus hyicus в достатній мірі не проводилися, а його роль в етіології інфекційних захворювань свиней повністю не вивчена.
Мета і завдання досліджень. Метою нашої роботи було вивчення біологічних властивостей Staphylococcus hyicus і його ролі в патології свиней. Виходячи з цього, перед нами були поставлені наступні завдання:
1. Вивчити екологію, біологічні властивості і чутливість виділених культур Staphylococcus hyicus до антимікробних препаратів.
2. Вивчити патогенні властивості Staphylococcus hyicus для поросят.
3. Вивчити фактори патогенності виділених культур Staphylococcus hyicus.
4. Розробити метод ідентифікації Staphylococcus hyicus полімеразної ланцюгової реакцією.
1.3. Наукова новизна. Проведено дослідження по виділенню Staphylococcus hyicus з різних джерел, в тому числі з шкіри здорових і хворих ексудативним епідерміта поросят, а також від інших видів тварин.
Вивчено біологічні властивості і визначена in vitro чутливість 40 штамів Staphylococcus hyicus до 17 антимікробних препаратів.
Вивчено фактори патогенності даних бактерій.
Вперше в Російській Федерації проведено дослідження виділених ізолятів S. hyicus полімеразної ланцюгової реакцією на наявність генів, що детермінують синтез ексфоліативних токсинів exhA, exhB, exhC і exhD.
Виявили, що штами Staphylococcus hyicus, виділені від свиней з ознаками ексудативного епідерміта в господарствах Бєлгородської області, містять ген exhD, що детермінують синтез ексфоліативного токсину D.
Розроблено метод ідентифікації Staphylococcus hyicus по виявленню полімеразної ланцюгової реакцією гена sodA видоспецифічності супероксиддисмутази.
Практична цінність роботи. Показано носійство Staphylococcus hyicus декількома видами сільськогосподарських тварин (свині, велика рогата худоба, а також птицею), доведена роль Staphylococcus hyicus в патології свиней.
Розроблено метод ідентифікації Staphylococcus hyicus по виявленню полімеразної ланцюгової реакцією гена sodA видоспецифічності супероксиддисмутази.
1.5. Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи повідомлені на:
1.7. Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 116 сторінках машинописного тексту і включає вступ, огляд літератури, власні дослідження, обговорення результатів, висновки, практичні пропозиції і список літератури. Робота ілюстрована одним графіком, однією дентрограммой, чотирма малюнками, 10 таблицями і 8 фотографіями. Список використаної літератури включає 193 джерела, з яких 175 іноземних.
Таксономічне положення, поширення та біологічні властивості Staphylococcus hyicus
В даний час рід Staphylococcus разом з іншими, менш відомими,
Стафілококи - це нерухомі, каталазоположітельние, Грампі-зітівние коки, розміром від 0,6 до 1,3 мкм, в мазках розташовуються безладно парами, тетрадами або скупченнями в формі виноградних грон, є аеробами і факультативними анаеробами (R. Killper -Baelz і К . Schleifer, 1981; R. De la Fuente et al. 1985; K. Schleifer, 1986).
Стафілококи як збудники хвороб тварин
Доведено, що провідну роль в патології тварин грають три основних коагулазопозітівних виду стафілококів: S. aureus, S. intermedius і S. hyicus.
S. aureus є причиною шкірних поразок у різних видів тварин, викликаючи різного роду піодерміти і флегмони. Нерідко золотистий стафілокок викликає у дрібної і великої рогатої худоби гострі і хронічні мастити, що доходять іноді до гангренозний форми.
Роль Staphylococcus hyicus в патології сільськогосподарських тварин і птахів
Патогенез. L. Johnes (1956, 1961) і Н. Behrens (1958) описують ексудативний епідерміт як спонтанно виникає генералізований дерматит, хворіють яким поросята у віці від 5 до 35 днів. Розрізняють три можливі форми перебігу хвороби:
сверхострую форму, при якій смерть наступає через три - п'ять днів після початку клінічних проявів;
гостру форму, з менш інтенсивними клінічними проявами і настанням смерті тварини протягом п'яти - восьми днів;
подострую форму, що триває три - чотири тижні і, як правило, не призводить до смерті поросят (L. Johnes, 1956).
Патолого - анатомічні зміни. Патологоанатомічні зміни при ексудативному епідермою концентруються в основному у верхніх шарах шкірного покриву.
За даними L. Johnes (1956) і N. Underdahl et al. (1965), невеликі рожеві бульбашки, що з'являються на шкірі спочатку захворювання, найчастіше розташовуються на верхній щелепі поросят, над очима, біля вух, в паховій області. З розвитком хвороби вони можуть з'являтися на задніх кінцівках і в області живота.
Пізніше з'являються сухі, від жовто - коричневого до коричневого кольору струпи (скоринки), легко відділяються від тіла. Під час гістологічного дослідження ураженої ексудативним епідерміта шкіри L ecuyer і Jericho (1966) виявили руйнування міжклітинних зв'язків, а також потовщення шару епідермісу в шість - сім разів. Такі патологічні зміни схожі зі змінами при паракератозі.
Дослідження деяких вчених вказують на розвиток у хворих ексудативним епідерміта поросят поліартриту.
Диференціальний діагноз. В першу чергу ексудативний епідерміт слід диференціювати від інших захворювань, що характеризуються ураженнями шкірного покриву, такими як віспа свиней, паракератоз, грибкових уражень шкіри.
Виділення Staphylococcus hyicus з різних джерел
Бактеріологічному дослідженню на предмет виділення S. hyicus піддали 371 пробу матеріалу від різних тварин, як з патологіями, так і без них, в тому числі 328 проб від сільськогосподарських тварин (свиней, поросят і корів), 30 проб від птахів (30 курок у віці 360 - 420 днів), 13 проб від собак.
На наявність Staphylococcus hyicus досліджували: зіскрібки з шкіри поросят з ознаками ексудативного епідерміта (78 проб) і здорових поросят (56 проб), змиви з кон'юнктиви очей поросят (43 проби), мазки з піхвової порожнини свиноматок без ознак патології (33 проби), змиви з сосків вимені (33 проби) від хворих на мастит корів, мазки слизової носової порожнини поросят (24 проби), проби з внутрішніх органів полеглих і вимушено забитих поросят з ознаками ексудативного епідерміта (11 проб) і пневмонії (6 проб), проби молока (9 проб) від хворих на мастит корів, а також роби гною (9 проб) від хворих ендометритом корів.
Крім того, були досліджені змиви кон'юнктиви і мазки ротової порожнини (30 проб) від курок без патології, гній раневого вмісту від собак (5 проб) і корів (11 проб), зіскрібки з шкіри собак (8 проб) і корів (15 проб) без патології.
У таблиці 4 наведено характеристику досліджених нами штамів по виду тварин, від яких вони виділені, джерела виділення та клінічними проявами, якщо такими даними ми мали.
Як видно з таблиці, більшість досліджених нами штамів (36, або 78%) були виділені від поросят і свиней, з них від поросят з ознаками ексудативного епідерміта - 18 штамів (42%). Від корів з ознаками субклінічного і клінічного маститу і ендометриту виділено 4 (8,6%) культури S. hyicus, від птахів без патології - 1 (2,2%), від собак без патології - 1 штам (2,2%). Крім того, варто відзначити, що при відборі проб патматеріалу з шкіри поросят, хворих ексудативним епідерміта, виделяемость даного стафілокока становила 100%.
Патогенетичне значення штамів, отриманих нами для дослідження з Німеччини, на жаль, було не відомо. З 26 штамів, ізольованих в Росії, тільки чотири штами (15,4%) були отримані від тварин без явних клінічних проявів будь - яких захворювань.
Вивчення біологічних властивостей виділених культур X hyicus показало те, що вони мають багато властивостей, типовими для інших представників роду Staphylococcus.
У даній роботі досліджені біологічні властивості 43 культур
S. hyicus, 26 з яких були виділені нами в різних тваринницьких / 25 штамів / і птахівничому / 1 штам / господарствах Бєлгородської області, а 17 отримані з Лабораторії бактеріології Інституту гігієни та інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин Університету Юстуса Лібіга (м Гіссен, Німеччина) .
Культури S. hyicus, ізольовані від різних тварин і птахів, по культурально - морфологічним, біохімічним і патогенним властивостям відповідали своєму роду.
В основному вони росли у вигляді чистих культур, особливо при первинному посіві досліджуваного матеріалу на елективні живильні середовища (ЖСА, ЕСА), які виявилися більш сприятливими, у порівнянні зі звичайними (кров'яний агар, МПА) живильними середовищами. Посіви на останніх іноді супроводжувалися забрудненням і труднощами отвивки чистих стафілококових культур, іноді потрібні додаткові пересівання на ЕСА або ЖСА. За морфологічними властивостями в мазках, пофарбованих за Грамом, S. hyicus був коки (діаметром 0,6 - 1,2 мкм), що розташовувалися безладними скупченнями, за формою найчастіше нагадують грона винограду, рідше попарно або тетрадами, нерухомі, спор і капсул не утворювали, добре фарбувалися аніліновими барвниками, грампозитивні. На морфологію S. hyicus кількість пасажів на середовищах не впливало.
Після виділення чистих культур стафілококів визначали їх біохімічні та культуральні властивості. Результати даних досліджень представлені в таблиці 5.
Культури S. hyicus були термофільними, тобто не росли при температурі + 45 ° С, слабо і повільно розвивалися при температурі + 15 С.