Кріозбереження - один з найбільш перспективних способів збереження генофонду вищих рослин і тварин. Воно дозволяє зберігати органи, тканини і клітини в замороженому стані при температурі рідкого азоту (-196 ° С). Зберігається в цих умовах матеріал залишається генетично стабільним і не схильний до змін, які відбуваються з організмами при зберіганні звичайними способами.
Розвиток кріобіології (науки про дію низьких температур на живі організми) почалося в 1900 році, коли К. Лінде і Дж. Дьюар отримали в значних кількостях рідкий повітря, що складається з азоту і водню. Витримуються в ньому бактерії в подальшому не тільки оживали, але і зберігали свої властивості.
Основними критичними моментами кріозбереження є утворення льоду всередині і поза клітинами організму і їх дегідратація (зневоднення).
Освіта позаклітинного і внутрішньоклітинного льоду полягає в тому, що зниження температури навколишнього середовища нижче точки замерзання розчину призводить до його переохолодження, утворення льоду навколо клітин і виникнення центрів кристалізації. Вода виходить з клітин і замерзає на поверхні зовнішнього льоду.
Освіта внутрішньоклітинного льоду зазвичай пошкоджує клітини, і тільки в разі формування дуже дрібних (склоподібних) кристалів льоду вони можуть далі розвиватися.
Клітини рослин є більш важким об'єктом для кріоконсервації, ніж клітини тварин. Це пов'язано з їх більш великими розмірами: розмір рослинної клітини 15-1000 мкм, а розмір клітин тварин 7-25 мкм. Крім того, рослинні клітини містять спеціальні органели - міцну целлюлозную стінку. Особливо ускладнює зневоднення наявність системи вакуолей. Центральна вакуоль в клітинах рослин може займати до 90% від їх загального обсягу, що ускладнює їх зневоднення.
Технологія кріозбереження базується на закономірності, що при кріозбереження (кріоконсервації) клітини переходять в стан глибокого анабіозу і після тривалого перебування в ньому повертаються в звичайне (нормальне) стан.
Основні етапи кріозбереження.
- Попереднє культивування клітин або організмів. При цьому враховують стійкість їх до дії складу середовища культивування, а також відповідність віку, стадії росту і кількості клітин перед витяганням.
- Розфасовка підготовленого матеріалу в контейнери. При цьому для заморожування і зберігання підготовлених клітин або організмів використовують різноманітні типи контейнерів. Розфасовку проводять в стерильних умовах.
Більш досконалим методом зберігання генофонду є кріозбереження (в рідкому азоті), де повністю припиняються всі метаболічні процеси. Він гарантує стабільне збереження генетичних характеристик об'єктів протягом практично будь-якого терміну. Його можна застосовувати для збереження генофонду широкого діапазону об'єктів - від ізольованих протопластів до зародків і насіння.
В даний час метод заморожування і зберігання розроблений не більше ніж для 60 видів рослин. Так, в кріобанку Інституту фізіології рослин РАІ зберігаються в рідкому азоті культивовані клітини ряду ліній і мутантів різних рослин, в тому числі вже понад 20 років культура моркви. Співробітниками цього інституту спільно з ПІІ картопляного господарства розроблені методи кріозбереження меристем багатьох сортів картоплі. В середньому з 20% зберігаються меристем регенерують рослини, які при висадці в поле за всіма ознаками не відрізняються від звичайних пробіркових рослин.
Найбільш проста техніка кріозбереження пилку. Підсушену пилок поміщають в поліетиленові ампули і прямо переносять в пенали, що знаходяться в посудині Дьюара з рідким азотом. У 5 сортів картоплі пилок, размороженная після 1, 2 і 3 років зберігання, мала високу життєздатність, фертильність і була ефективно використана при схрещуванні.
Складнішою є технологія кріозбереження культивованих клітин, меристем, кінчиків пагонів, зародків, так як необхідно захистити заморожувані клітини і тканини від осмотичного стресу і механічного руйнування структур кристалами льоду, а також забезпечити життєздатність при опаіваніі і рекультивації. Глибоке заморожування - зберігання - відтавання є Сильний вплив.
Технологія включає наступні етапи:
- підготовка культури (спеціальне попереднє культивування),
- додавання кріопротектори,
- програмне заморожування,
- зберігання в рідкому азоті,
- швидке відтавання,
- видалення кріопротектори,
- рекультівірованіе і регенерація рослин.
Кріопротектори - це речовини, які при заморожуванні повинні зменшити пошкодження клітин від осмотичного і механічного стресів. Кріопротекторами служать:
- диметилсульфоксид,
- гліцерин,
- полівінілпіролідон,
- поліетиленгліколь,
- декстран і ін.
Передобробка клітин осмотически активними речовинами (манітом, сорбітом, пролином і іншими амінокислотами) також допомагає захистити їх від стресів, підвищуючи виживання після глибокого заморожування і відтавання.
Режим заморожувати на етапі від 0 до -40 ° С може бути повільним (0,5-1,0 ° С / хв) або надшвидким (безпосереднє занурення в рідкий азот об'єкта розміром до 0,5 мм). При цьому заморожування в повільному режимі дає більш успішні результати, але вимагає спеціального устаткування (програмний заморажіватель).
Відтавання і відновлення зростання культур часто є критичний етап процесу. Для ряду видів розроблені свої методики, що включають певну швидкість, температуру та інші характеристики. Уже зараз Кріобанку можуть полегшити роботу селекціонерів, надавши їм можливість широко використовувати пул генів сортів і диких видів. При цьому можна зберегти без генетичних змін унікальні гібридні, мутантні і трансформовані лінії.