Cпособность клітин підтримувати високу упорядкованість своєї організації залежить від генетичної інформації, яка зберігається в формі дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). ДНК - це речовина, з якої складаються гени. Розмноження живих організмів, передача спадкових властивостей з покоління в покоління і розвиток багатоклітинного організму із заплідненої яйцеклітини можливі тому, що ДНК здатна до самовідтворення. Сам процес самовідтворення ДНК називається реплікацією. Іноді використовують також назва-синонім - редуплікація.
Матричний синтез ДНК
ДНК-полімерази
У 1957 році А. Корнберг виявив у кишкової палички фермент, що каталізує процес полімеризації ДНК з нуклеотидів; він був названий ДНК полімеразою. Потім ДНК-полімерази виявили і в інших організмах. Було показано, що субстратами всіх цих ферментів служать дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), полімеризуються на одноцепочечной
ДНК-матриці. ДНК-полімерази послідовно нарощують одноцепочечную ланцюг
ДНК, крок за кроком приєднуючи до неї наступні ланки в напрямку від 5 'до
3'-кінця, причому вибір чергового дНТФ диктується матрицею. Приєднання кожного нового нуклеотидного залишку до 3'-кінця зростання ланцюга супроводжується гідролізом багатою енергією зв'язку між першим і другим фосфатними залишками в дНТФ і отщеплением пірофосфату, що робить реакцію в цілому енергетично вигідною.
У клітинах зазвичай присутні кілька типів ДНК-полімерази, що виконують різні функції і мають різну будову: вони можуть бути побудовані з різної кількості білкових ланцюгів (субодиниць), від однієї до десятків.
Однак всі вони працюють на будь-яких послідовностях нуклеотидів матриці; задача цих ферментов- зробити точну копію кожної матриці.
Точність синтезу ДНК і механізм корекції
Генетичний матеріал живих організмів має величезні розміри і реплицируется з високою точністю. В середньому в процесі відтворення генома ссавця, що складається з ДНК довжиною 3 млрд пар нуклеотидів, виникає не більше трьох помилок. При цьому ДНК синтезується надзвичайно швидко (швидкість її полімеризації коливається в межах від 500 нуклеотидів / с у бактерій до 50 нуклеотидів / с у ссавців). Висока точність реплікації, поряд з її високою швидкістю, забезпечується наявністю спеціальних механізмів, що здійснюють корекцію, тобто усувають помилки. Суть механізму корекції полягає в тому, що ДНК-полімерази двічі перевіряють відповідність кожного нуклеотиду матриці: один раз перед включенням його до складу зростаючої ланцюга і другий раз перед тим, як включити наступний нуклеотид. Чергова фосфодіефірная зв'язок синтезується лише в тому випадку, якщо останній (3'-кінцевий) нуклеотид зростання ланцюга ДНК утворив правильну уотсон-криковських пару з відповідним нуклеотидом матриці. Якщо ж на попередній стадії реакції відбулося помилкове спаровування підстав, то подальша полімеризація зупиняється до тих пір, поки помилка не буде виправлена. Для цього фермент переміщається у зворотному напрямку і вирізає останнє доданий ланка, після чого його місце може зайняти правильний нуклеотідпредшественнік. Іншими словами, багато (але не всі) ДНК-полімерази володіють, крім 5'-3'-синтетичної активності, ще і 3'-гідролізу активністю, яка забезпечує видалення помилково спарених з матрицею нуклеотидів.
Основні принципи реплікації
Основні правила, відповідно до яких відбувається реплікація, були з'ясовані в дослідах з бактеріями, однак вони справедливі також і для вищих організмів.
Ініціація ланцюгів ДНК
ДНК-полімерази не можуть починати синтезу ДНК на матриці, а здатні лише додавати нові дезоксірібонуклеотідние ланки до 3'-кінця вже наявної полінуклеотидних ланцюга. Таку заздалегідь утворену ланцюг, до якої додаються нуклеотиди, називають запалом. Коротку РНК приманку синтезує з рибонуклеозидтрифосфатов фермент, що не володіє коректує активністю і званий ДНК-праймазой (від англ. Primer - запал). Праймазная активність може належати або окремому ферменту, або одній з субодиниць ДНК-полімерази. Запал, синтезована цим неточним ферментом, що не уміє виправляти помилки, відрізняється від решти новосинтезованих ланцюга ДНК, оскільки складається з рибонуклеотидов, і далі може бути видалена.
Розмір рібонуклеотідной затравки невеликий (менше 20 нуклеотидів) в порівнянні з розміром ланцюга ДНК, утвореною ДНК-полімеразою. Виконала свою функцію
РНК-запал віддаляється спеціальним ферментом, а утворена при цьому пролом закладається ДНК-полімеразою, що використовує в якості затравки 3'-ОН-кінець сусіднього фрагмента Окадзакі (див нижче). Видалення крайніх РНК-праймерів, комплементарних 3'-кінців обох ланцюгів лінійної материнської молекули ДНК, призводить до того, що дочірні ланцюга виявляються коротше на 10-20 нуклеотидів
(У різних видів розмір РНК-затравок різний). У цьому полягає так звана "проблема недореплікаціі решт лінійних молекул". У разі реплікації кільцевих бактеріальних ДНК цієї проблеми не існує, так як перші за часом освіти РНК-затравки видаляються ферментом, який одночасно заповнює утворюється пролом шляхом нарощування 3'-ОН-кінця зростання ланцюга ДНК, спрямованої в "хвіст" видаляється праймеру. Проблема недореплікаціі 3'-решт лінійних молекул ДНК вирішується еукариотическими клітинами за допомогою спеціального ферменту - теломерази.
Робота теломерази
У 1985 році він був виявлений у равнореснічной інфузорії Tetrahymena thermophila, а згодом - в дріжджах, рослинах і тваринах, в тому числі в яєчниках людини і імморталізованних (безсмертних) лініях ракових клітин
HeLa. Теломераза є ДНК-полімеразою, добудовують 3'-кінці лінійних молекул ДНК хромосом короткими (6-8 нуклеотидів) повторюваними послідовностями (у хребетних TTAGGG). Згідно номенклатурі, цей фермент називають ДНК-уклеотіділекзотрансферазой або теломерной термінальної трансферази. Крім білкової частини теломераза містить РНК, що виконує роль матриці для нарощування ДНК повторами. довжина теломеразной
РНК коливається від 150 нуклеотидів у найпростіших до 1400 нуклеотидів у дріжджів, у людини - 450 нуклеотидів. Сам факт наявності в молекулі РНК послідовності, по якій йде матричний синтез шматка ДНК, дозволяє віднести теломеразу до своєрідну обернену транскриптазе, тобто ферменту, здатному вести синтез ДНК по матриці РНК.
В результаті того що після кожної реплікації дочірні ланцюга ДНК виявляються коротше материнських на розмір першого РНК-праймера (10-20 нуклеотидів), утворюються виступаючі однониткових 3'-кінці материнських ланцюгів. Вони-то і впізнаються теломеразой, яка послідовно нарощує материнські ланцюга
(У людини на сотні повторів), використовуючи 3'-ОН-кінці їх в якості запалів, а РНК, що входить до складу ферменту, як матрицю.
Утворені довгі одноцепочечниє кінці, в свою чергу, служать матрицями для синтезу дочірніх ланцюгів по традиційному реплікативного механізму.
Поступове скорочення ДНК хромосом під час реплікації є однією з теорій "старіння" клітинних колоній. Ще в 1971 році вітчизняний вчений
А.М. Оловников в своїй теорії маргінотоміі (від лат. Marginalis -краевой, tome - перетин) припустив, що це явище лежить в основі обмеженого потенціалу подвоєння, спостережуваного у нормальних соматичних клітин, що ростуть в культурі in vitro, так званого "ліміту Гейфліка".
Американський вчений Леонард Хейфлик на початку 60-х років показав, що якщо для культивування взяти клітини новонароджених дітей, то вони можуть пройти
80-90 поділів, в той час як соматичні клітини від 70-річних діляться тільки 20- 30 раз. Обмеження на число клітинних поділів і називають лімітом Хейфліка.
Розплітання подвійної спіралі ДНК
Оскільки синтез ДНК відбувається на одноцепочечной матриці, йому повинно передувати обов'язкове поділ (хоча б на час) двох ланцюгів ДНК.
Дослідження, проведені на початку 60-х років на реплицирующихся хромосомах, виявили особливу, чітко обмежену область реплікації, що переміщається уздовж батьківської спіралі ДНК і що характеризується місцевим розбіжністю двох її ланцюгів. Ця активна область з-за своєї Y-подібної форми була названа репликационной виделкою. Саме в ній ДНК-полімерази синтезують дочірні молекули ДНК. За допомогою електронної мікроскопії реплицирующейся ДНК вдалося встановити, що область, яка вже реплицирована, має вигляд вічка усередині нерепліціровавшейся ДНК. Важливо відзначити, що реплікаційний вічко утворюється лише в тих місцях молекули, де знаходяться специфічні нуклеотидні послідовності. Ці послідовності, що отримали назву точок початку реплікації, складаються приблизно з 300 нуклеотидів. Залежно від того, в одному або в двох напрямках відбувається реплікація (а це залежить від природи організму), око містить одну або дві Реплікаційний вилки.
Послідовний рух вилки реплікації призводить до розширення вічка.
Подвійна спіраль ДНК вельми стабільна; для того щоб вона розкрилася, необхідні особливі білки. Спеціальні ферменти ДНК-ХЕЛІКАЗИ швидко рухаються по одиночній ланцюга ДНК, використовуючи для переміщення енергію гідролізу АТФ.
Зустрічаючи на шляху ділянку подвійної спіралі, вони розривають водневі зв'язки між підставами, поділяють ланцюга і просувають вилку реплікації. Слідом за цим з одиночними ланцюгами ДНК зв'язуються спеціальні дестабілізуючі спіраль білки, які не дозволяють одиночним ланцюгах ДНК зімкнуться. При цьому вони не закривають підстав ДНК, залишаючи їх доступними для спарювання.
Не слід забувати, що комплементарні ланцюга ДНК закручені один навколо одного в спіраль. Отже, для того щоб репликационная вилка могла просуватися вперед, вся ще не подвоєна частина ДНК повинна була б дуже швидко обертатися. Ця топологічна проблема вирішується шляхом освіти в спіралі свого роду "шарнірів", дозволяють ланцюгах ДНК розкрутитися.
Належать до особливого класу білки, звані ДНК-топоізомеразами, вносять в ланцюг ДНК одне дволанцюжкові розриви, що дозволяють ланцюгах ДНК розділитися, а потім закладають ці розриви. Топоізомерази беруть участь також в расцеплении зачеплених дволанцюжкових кілець, що утворюються при реплікації кільцевих двунітевих ДНК. За допомогою цих важливих ферментів подвійна спіраль
ДНК в клітині може приймати "недокрученную" форму з меншим числом витків; в такий ДНК легше відбувається розбіжність двох ланцюгів ДНК в вилці реплікації.
Переривчастий синтез ДНК
Легко уявити, що реплікація відбувається шляхом безперервного зростання нуклеотида за нуклеотидом обох нових ланцюгів у міру переміщення вилки реплікації; при цьому, оскільки два ланцюги в спіралі ДНК антіпараллельни, одна з дочірніх ланцюгів повинна була б зростати в напрямку
5'-3 ', а інша в напрямі 3-5'. Насправді, однак, виявилося, що дочірні ланцюга ростуть тільки в напрямку 5'-3 ', тобто завжди подовжується 3'-кінець затравки, а матриця зчитується ДНК-полімеразою в напрямі 3-5'. Це твердження на перший погляд здається несумісним з рухом вилки реплікації в одному напрямку, що супроводжується одночасним зчитуванням двох антипаралельних ниток. Розгадка секрету полягає в тому, що синтез ДНК відбувається безперервно тільки на одній з матричної ланцюгів. На другий матричної ланцюга ДНК синтезується порівняно короткими фрагментами (довжиною від 100до 1000 нуклеотидів, залежно від виду), названими по імені виявив їх вченого фрагментами Окадзакі).
Новостворена ланцюг, яка синтезується безперервно, називається провідною, а інша, що збирається з фрагментів Окадзакі, що відстає. Синтез кожного з цих фрагментів починається з РНК-затравки. Через деякий час
РНК-затравки видаляються, проломи забудовуються ДНК-полімеразою і фрагменти зшиваються в один безперервний ланцюг ДНК спеціальним ферментом.
Кооперативний дію білків вилки реплікації.
До сих пір ми говорили про участь окремих білків в реплікації так, як ніби-то вони працюють незалежно один від одного. Тим часом насправді велика частина цих білків об'єднана в крупний комплекс, який швидко рухається уздовж ДНК і погоджено здійснює процес реплікації з високою точністю. Цей комплекс порівнюють з малесенькою
"Швейної машиною". "Деталями" його служать окремі білки, а джерелом енергії - реакція гідролізу нуклеозідтріфос фатов. Спіраль розплітається ДНК ХЕЛІКАЗОЙ; цього процесу допомагають ДНК топоізомераза, що розкручує ланцюга
ДНК, і безліч молекул дестабілізуючого білка, що зв'язуються з обома одиночними ланцюгами ДНК. В області вилки діють дві ДНК-полімерази - на провідній і відстає ланцюга. На провідною ланцюга ДНК-полімераза працює безперервно, а на відстає фермент час від часу перериває і знову відновлює свою роботу, використовуючи короткі РНК-затравки, синтезовані
ДНК-праймазой. Молекула ДНК-ПРАЙМАЗИ безпосередньо пов'язана з ДНК ХЕЛІКАЗОЙ, утворюючи структуру, звану праймосомой. Праймосома рухається в напрямку розкриття вилки реплікації і по ходу руху синтезує
РНК-затравки для фрагментів Окадзакі. У цьому ж напрямку рухається ДНК полімераза провідною ланцюга і, хоча на перший погляд це важко уявити,
ДНК-полімераза відстає ланцюга. Для цього, як вважають, останні накладає ланцюг ДНК, яка служить їй матрицею, саму на себе, що і забезпечує розворот ДНК-полімерази відстає ланцюга на 180 градусів.
Узгоджений рух двох ДНК-полімераз забезпечує координовану реплікацію обох ниток. Таким чином, в вилці реплікації одночасно працюють близько двадцяти різних білків (з яких ми назвали тільки частина), здійснюючи складний, високоупорядоченние і енергоємний процес.
Узгодженість процесів реплікації ДНК і клоеточного ділення
Еукаріотична клітина перед кожним діленням повинна синтезувати копії всіх своїх хромосом. Реплікація ДНК еукаріотичної хромосоми здійснюється за допомогою разделени хромосоми на безліч окремих репліконов. Такі реплікони активуються в повному обсязі одночасно, проте клітинному діленню повинна передувати обов'язкова одноразова реплікація кожного з них. Зі сказаного ясно, що по хромосомі еукаріот в кожен момент часу може рухатися незалежно один від одного безліч Реплікаційний вилок. Зупинка просування вилки відбувається тільки при зіткненні з іншого виделкою, що просувалася в протилежному напрямку, або після досягнення кінця хромосоми. В результаті вся ДНК хромосо ми в короткий термін виявляється реплікованих. Після складання на молекулі ДНК хромосомних білків кожна пара хромосом в процесі мітозу впорядковано розділяється по дочірнім клітинам.
висновки
Процес реплікації ДНК узгоджений з клітинним поділом і требуетсовместного дії багатьох білків. У ньому беруть участь:
1. ДНК-ХЕЛІКАЗИ і дестабілізуючі білки; вони розплітає подвійну спіраль батьківської ДНК і формують вилку реплікації.
2. ДНК-полімерази, які каталізують синтез полінуклеотидних ланцюга ДНК в напрямі 3-5, копіюючи в вилці реплікації матрицю з високим ступенем точності. Оскільки два ланцюги подвійної спіралі ДНК антіпараллельни, в напрямі 5-3 'безперервно синтезується лише одна з двох ланцюгів, ведуча; інша ланцюг, отстающа, синтезується у вигляді коротких фрагментів
Окадзакі. ДНК-полімераза здатна до виправлення власних помилок, але не може самостійно почати синтез нового ланцюга.
3. ДНК-праймаза, яка каталізує короткі молекули РНК-затравки.
Згодом фрагменти РНК видаляються - їх замінює ДНК.
4.Теломераза, закінчує побудова недореплікацірованих 3'-решт лінійних молекул ДНК.
5. ДНК-топоізомерази, що допомагають вирішити проблеми кручення і сплутування спіралі ДНК.
6. инициаторного білки, що зв'язуються в точці початку реплікації і сприяють утворенню нового Реплікаційний вічка з однією або двома вилками. У кожній з вилок услід за инициаторного білками до розплетеною
ДНК спочатку приєднується білковий комплекс, що складається з ДНК-ХЕЛІКАЗИ і
ДНК-ПРАЙМАЗИ (праймосома).
Потім до праймосоме додаються інші білки і виникає "репликационная машина", яка і здійснює синтез ДНК.