Методи збереження генофонду
Методика кріоконсервації, способи уповільнення зростання
При отриманні клітинних ліній з корисними ознаками постає проблема збереження цих ознак. Рослини можуть зберігати генетичну інформацію в насінні, проте це джерело не цілком надійний, так як з часом через мутацій схожість насіння падає. Крім того, деякі рослини розмножуються тільки вегетативно. Цим обумовлена необхідність збереження частини матеріалу in vitro. З іншого боку, в деяких випадках вдається отримати нові клітинні лінії, які синтезують більшу кількість вторинних метаболітів, тобто більш продуктивні, які теж потребують збереження.
Для дослідження фізіологічних і біохімічних процесів, що протікають в тканинах, також потрібні стандартні вихідні культури, чим викликана необхідність зберігати матеріал протягом певного проміжку часу, коли йдуть серійні експерименти. Все це робить проблему збереження генофонду досить актуальною.
Можна, звичайно, пасерувати і перещеплюваних клітинні культури. Однак при цьому виникає небезпека сомаклональної мінливості, накопичення мутацій, контамінацій (зараження чужорідним генетичним матеріалом). Це також вимагає певних фінансових і трудових витрат (необхідність частих пересадок, витрати, пов'язані із середовищем і т.д.). Мета дослідників полягає в збільшенні інтервалу між пересадками. Існує різні підходи до збереження культур:
- сушка (розпилювальна і лиофильная) - для клітин мікроорганізмів.
Кріозбереження - заморожування при наднизьких температурах. Зазвичай його проводять в рідкому азоті при температурі -196 o C.
Успіх низькотемпературної консервації залежить від ряду факторів:
- вид і тип клітин,
- їх концентрація в суспензії,
- склад середовища для консервування,
- вид і концентрація кріопротектора,
- режим охолодження і відігрівання,
- спосіб реабілітації клітин після відігрівання.
Істотну роль в успішному заморожуванні клітин відіграє їх морфофизиологическое стан: клітини, що знаходяться в стаціонарній фазі росту, менш стійкі до шкідлива дія низькотемпературної консервації, ніж клітини, які знаходяться в експоненційної фазі росту. Клітини для заморожування відбирають в середині експоненційної фази ростовой кривої.
Важливе значення має і щільність замораживаемой суспензії. Оптимальні результати по відновленню клітин були отримані при заморожуванні клітинної суспензії щільністю 1 * 10 5 - 5 * 10 6 клітин в 1 мл.
Для рослинних клітин часто потрібна попередня культивування в особливих умовах. У середу додають різні речовини, наприклад:- 2-6% маннит або сорбіт для зменшення розміру вакуолей;
- амінокислоти, в першу чергу пролин, який служить для зв'язування води в клітці (концентрація до 1 благаючи або 11,5%), аспарагін, # 947; -аміномасляную кислоту;
- диметилсульфоксид (ДМСО), який додають до середовища для предкультівірованія в концентрації від 2,5 до 10% на 48 годин для збільшення проникності цитоплазматичної мембрани;
- крім того, застосовують штучне загартовування до холоду, коли знижують температуру культивування, імітуючи природний осінній процес підготовки до періоду зимового спокою (застосовується лише для рослин помірного клімату). Клітинні культури витримують кілька діб при температурі +8 - +10 o C, а потім при +2 - +5 o C протягом 1 - 6 тижнів.
Процес заморожування рослинних клітин від тварин відрізняє, в основному, наявність етапу попереднього культивування.
Кріопротектори - речовини, що дозволяють знизити шкідливу дію фізико-хімічних факторів при кріоконсервуванні. До них відносяться сахароза, декстран, етиленгліколь, полівінілпіролідон, диметилсульфоксид (ДМСО), гліцерин. Для визначення токсичності кріопротектори клітини витримують при кімнатній температурі в різних його концентраціях протягом 30 - 50 хвилин, після чого визначають їх життєздатність. Додатково оцінюють його протективного властивості шляхом пробного заморожування і відтавання культур. Найбільш часто в якості кріопротекторів використовують гліцерин і ДМСО. Перед додаванням кріопротектори суспензію клітин концентрують шляхом центрифугування, надосадову рідину зливають. Кріопротектори вносять в культуру за годину до заморожування, що призводить до зміни проникності мембрани, зміни точки замерзання і відтавання.
Програми охолодження можуть бути різними, але для всіх них характерна повільна швидкість охолодження. При заморожуванні відбувається утворення льоду всередині і зовні клітин. Характер цих змін залежить від досліджуваного зразка і обробки кріопротекторами, але головним чином, від швидкості охолодження. При повільному охолодженні відбувається утворення позаклітинного льоду, що приводить до зневоднення клітини до того, як буде досягнута точка замерзання цитоплазми. При швидкому охолодженні клітини швидше заморожуються зсередини, повільніше обезвоживаются, що призводить до утворення кристалів льоду всередині клітини. В цьому випадку клітини пошкоджуються. Зазвичай охолодження проводять в два етапи (рис. 26):
Мал. 26. Заморожування клітин: а) швидке, б) повільне, поетапне
1-й етап: від +20 до -28 o C зі швидкістю 1 градус в хвилину (для рослинних клітин швидкість заморожування 0,5 градуса в хвилину до -35 ° С), витримують при цій температурі 15 хвилин.
2-ий етап: занурення в рідкий азот (миттєве охолодження до - 196 o C).
Заморожування виробляють в спеціальних апаратах. При їх відсутності - на спиртовій лазні (0,5 - 1 літр спирту наливають в термос з металевою колбою, занурюють в нього ампули на 15 хвилин і додають при помішуванні рідкий азот або сухий лід; доводять температуру до -32 o C (температура повинна бути не вище -28 і не нижче -32 ° С). Далі переносять ампули в рідкий азот.
При розморожуванні ампули пінцетом переносять у водяну баню з температурою +37 - +40 о С, ампула об'ємом в 1 мл розморожується протягом 0,5 - 1 хвилини.
Після розморожування клітини відмивають або в ростовий середовищі (тварини), або в підтримуючої середовищі. Рослинні клітини також можна відмивати 3 - 10% розчином сахарози.
Далі клітини перевіряють на життєздатність за допомогою вітальних барвників, фарбувальних мертві клітини. Остаточним критерієм служить чітке відновлення зростання на стандартних поживних середовищах, що використовуються для вирощування цієї культури.
Перещеплюваних клітин тварин після розморожування мають підвищену чутливість до вірусів, яка проявляється протягом перших двох пасажів. Далі чутливість повертається до вихідної.
Уповільнення зростання можна домогтися наступними методами:
1. Зберігання під шаром мінерального масла (для бактеріальних і грибних культур).
2. Зміна газового складу і атмосферного тиску всередині культурального судини.
3. Зміна світлового режиму.
4. Охолодження до температури припинення активного зростання.
5. Застосування гормональних і осмотичних інгібіторів. З гормональних інгібіторів найбільш часто використовують хлорхолінхлорид (для рослинних клітин), з осмотических - маніт в концентрації 3-6%.
6. Заміна СaCl2 на Ca (NO3) 2 в поживних середовищах.
Для картоплі в якості способу, що дозволяє зберегти генофонд, рекомендується клубнеобразование в пробірках.
Інші розділи: