Одним з найважливіших етапів програми ЕКЗ є ембріологічний етап. Саме від того, як буде виконано оцінку якості яйцеклітини, проведена процедура запліднення, а також подальше культивування зигот і ембріонів залежить успішний результат екстракорпорального запліднення.
Ембріологічний етап програми ЕКО триває не більше 6-7 діб. Умовно його можна розділити на кілька стадій, опис яких наведено далі.
День «-1» - підготовча стадія
На даній стадії ембріолог готує всі необхідні матеріали для проведення процедури пункції фолікулів і запліднення. У цей день маркуються і нумеруються всі планшети, чашки Петрі, ставляться на прогрів (необхідно суворе дотримання температурного режиму) і еквілібровку (доведення рН до величин 7.35-7.45) все середовища, необхідні для промивки фолікулів і ооцитів, обробки сперми і запліднення.
День «0» - пункція фолікулів (аспірація яйцеклітин) і запліднення
На момент пункції фолікулів, яйцеклітини знаходяться в вигляді ооцітарно-кумулюсні комплексу (ОКК). Фолікулярну рідину, отриману при трансвагінальної пункції ембріолог перевіряє під стереомикроскопом (або неозброєним оком) на наявність ОКК, які виглядають як сизі слизові згустки розміром 5-10 мм. Швидко відібрані ОКК поміщаються в культуральне середовище, де фахівець попередньо оцінює їх кількість, якість і ступінь зрілості. Важливо розуміти, що морфологія комплексів не завжди дозволяє дати справжню оцінку ступеня зрілості і стану самої яйцеклітини.
У пунктіровать яйцеклітині має бути закінчено перший розподіл мейозу, після якого відділяється перших полярних тільце. Друге поділ, як правило, знаходиться в стадії метафази. Хромосоми утворюють ряд, створюючи тим самим метафазну пластинку, що розташовується прямо над полярним тільцем. При цьому в яйцеклітині здійснюється блок мейозу, зняти який здатний лише сперматозоїд, проникли крізь оболонку.
На наведених нижче фотографіях наведені приклади зрілих і незрілих яйцеклітин. Ооцит людини з «ідеальними» параметрами має світлу, помірно гранулярную цитоплазму, невелике перівітеллінового простір, интактное перших полярних тіло, круглу і безбарвну зону пеллюціда. Однак більше 50% всіх одержуваних ооцитів в ціклахстімуляціі суперовуляції мають одну і більше морфологічну аномалію!
Відповідно до сучасних уявлень, якість ооцита має критичне значення для розвитку ембріона і наступ клінічної вагітності!
Сперматозоїду, перед тим, як проникнути в ооцит, наслідком чого стає запліднення яйцеклітини, належить подолати ряд перешкод. По-перше, кумулюс (Сumulus) - проникаючи всередину нього глибше, сперматозоїд збільшує свою швидкість, демонструючи фазу гіперактивності. По-друге, зона пеллюціда (Zona pellucida) - тут сперматозоїд зв'язується з рецептором.
Після цього здійснюється реакція, при якій цитоплазматическая мембрана яйцеклітини і мембрана сперматозоїда об'єднуються. Вміст акросоми сперматозоїда викидається, зв'язується з зоною пеллюціда і сперматозоїд проникає через оболонку яйцеклітини, не втрачаючи своєї активності.
На тому місці, яке розташовується між оболонкою яйцеклітини і зоною пеллюціда, сперматозоїд приєднується своїми рецепторами до рецепторів, які розташовуються на оболонці яйцеклітини. Це сприяє виникненню кортикальной реакції, яка стає причиною незворотних процесів зони пеллюціда, що робить її недоступною для проникнення інших сперматозоїдів.
Подібним чином здійснюється запліднення в природному циклі і в техніці ЕКО (IVF). При важких формах чоловічого безпліддя, а також при низькій кількості / якості отриманих при трансвагінальної пункції ооцитів, застосовується процедура Інтрацитоплазматична перенесення сперматозоїда безпосередньо в цитоплазми ооцита (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection, скорочено ICSI або ІКСІ). Вперше Мікроін'єкції сперматозоїда в яйцеклітину провели Uehara і Yanagimachi в Японії в 1976 році. ІКСІ є найпоширенішою мікроманіпуляціонной технікою штучного запліднення, яка в даний час широко використовується в якості технологій допоміжної репродукції людини. Процедурі ІКСІ передують денудация ооцита (обробка препаратами ферменту гіалуронідаза, денюдірованіе (видалення клітин кумулюса)), обробка сперми (просте центрифугування, центрифугування в градієнті щільності, swim up).
День «1» - оцінка запліднення:
Через 16-18 годин після проведення процедури ІКСІ, або через 18-20 годин після IVF, оцінюється наявність ознак запліднення і якість зигот. Наявність в яйцеклітині 2-х пронуклеусов (PN) і 2 полярних тел (PB) вказує на нормальний розвиток процесу запліднення. Пронуклеуси - це ядра статевих клітин (сперматозоїда і яйцеклітини) несучих по половині генетичного матеріалу від кожного з батьків.
На цій стадії дуже важливо отбраковать аномально запліднити ембріони: моноплоіди (1 пронуклеус), Триплоїд (3) і поліплоїди (4 і більше).
Зиготи з 3 ядрами (пронуклеуса) можуть з'являтися в результаті:
- Запліднення ооцита 2-ма і більше сперматозоїдами (найчастіше 2-мя сперматозоїдами запліднюються яйцеклітини незадовільної якості)
- Запліднення ооцита аномальним сперматозоїдом з подвійним набором хромосом (всі клітини людини мають 46 хромосом - диплоїдний набір). Зріла яйцеклітина і сперматозоїд мають 23-гаплоїдний набір. Освіта сперматозоїда з подвійним набором хромосом (46) відбувається при порушеннях процесу дозрівання гамет.
- Невиділення ооцитом 2-го полярного тільця. Процес дозрівання яйцеклітини - це хромосомні перетворення ведуть до формування ооцита з гаплоїдний набором хромосом. Гаплоїдність досягається за рахунок виділення 2-х полярних тілець. Перше формується у яйцеклітини готової до запліднення, друге можна побачити після запліднення, тобто в нормі видно 2 полярних тільця.
Поліплоїди з'являються в результаті запліднення яйцеклітини незадовільної якості декількома сперматозоїдами або в результаті поєднання перерахованих вище факторів.
День «2» - початок дроблення
На 2-у добу після злиття генетичного матеріалу сперматозоїда і яйцеклітини відбувається дроблення - розподіл клітини на 2 або 4. Клітини дробящегося ембріона називаються бластомерами.
На цій стадії, а також на день «3», оцінюється рівномірність бластомерів, порядок їх орієнтації відносно один одного і, по можливості, кількість ядер в них (в нормі по 1).
День «3» - дроблення
Ще через добу ембріон, як правило, вже складається з 4-х, 6-ти або 8-ми бластомерів. Генетична програма ембріона запускається на 4-х клітинної стадії, в кінці друге - початку третьої доби розвитку. До цього моменту ембріон розвивався виключно за рахунок «запасів», накопичених в яйцеклітині за час її зростання і розвитку в яєчнику. Саме на третю добу запускається генетична програма сперматозоїди, і, якщо «генетична книга», в якій закодована програма нормального розвитку ембріона, містить помилки - такі собі «помилки» або мутації, ембріон зупиняється в розвитку. Це природний процес відбору генетично нормальних ембріонів. Тому саме на стадії 4-8 бластомерів до 20% ембріонів зупиняються в розвитку (так званий «блок розвитку»).
Причинами поганої якості ембріонів можуть бути погана якість сперми або погана якість яйцеклітини. Вважається, що якщо ембріон погано росте спочатку, то проблема в яйцеклітині, а якщо розвиток перші дві доби йде добре, а потім починаються проблеми, то справа в поганій якості сперми.
День «4» - морула
На 4-у добу розвитку ембріон людини складається вже, як правило, з 10-16 клітин, міжклітинні контакти поступово ущільнюються і поверхню ембріона згладжується (процес компактизації) - починається стадія морули (від лат. Morulae - шовковична ягода). До цієї стадії in vivo (в організмі матері) ембріон потрапляє з маткової труби в порожнину матки. До кінця 4-х діб розвитку всередині морули поступово утворюється порожнина - починається процес кавітації.
М 4 (А): ембріон повністю компактізован. Клітинні мембрани видно нечітко, але ядра помітні.
М 3 (В): компактізовано більше 75% бластомерів. Ембріон зберігає сферична форму і гладку поверхню.
М 2 (С): часткова компактизація (близько 50% бластомерів), аномальна морфологія ембріона.
М 1 (D): компактизація менше 50% бластомерів. Помітні без'ядерні фрагменти і некомпактізовавшіеся бластомери.
Приклад запису - (М3) - морула з компактизації більш 75% бластомерів.
День «5» - бластоциста
З того моменту, як порожнину всередині морули досягає більш 50% її обсягу, ембріон називається бластоцисти.
У нормі формування бластоцисти допускається з кінця 4-х до середини 6-х діб розвитку, частіше це відбувається на 5-ту добу. Бластоциста складається з двох популяцій клітин - трофобласт (трофектодерма (ТЕ), одношаровий епітелій, що оточує порожнину) і внутрішня клітинна маса (ВКМ (ICM), щільний грудку клітин). Трофобласт відповідає за імплантацію - впровадження ембріона в матковий епітелій (ендометрій). Клітини трофобласта дадуть надалі початок всім Позазародкова оболонок плоду, що розвивається, а з внутрішньої клітинної маси будуть формуватися всі тканини і органи майбутньої дитини. Чим більше порожнину бластоцисти і краще розвинена внутрішня клітинна маса і трофобласт - тим більше потенціал ембріона до імплантації. Коли порожнину бластоцисти досягає значного розміру, стоншена за рахунок розтягування блискуча оболонка (ZP) розривається і починається процес хетчинг (викльову) ембріона з блискучої оболонки. Тільки після закінчення цього процесу бластоциста здатна імплантуватися (прикріпитися) в ендометрій матки. Імплантація відбувається, як правило, на 5-7 день розвитку ембріона.
1 ступінь - рання бластоциста, порожнину бластоцисти менше половини обсягу ембріона.
2 ступінь - порожнину бластоцисти більше половини обсягу ембріона.
3 ступінь - повна бластоциста. Порожнина повністю займає обсяг ембріона.
4 ступінь - розширена бластоциста. Порожнина бластоцисти стає більше і починає стоншується ZP.
5 ступінь - трофектодерма нічінает проникати через ZP.
6 ступінь - вилупилася бластоциста, яка покинула ZP.
Внутрішньоклітинна маса (ВКМ):
А - щільно упакована з великою кількістю клітин.
В - більш вільна угруповання середньої кількості клітин.
З - незначна кількість клітин
А - багато клітин, що формують трофектодерму.
В - трохи клітин.
З - незначна кількість великих клітин.
Приклад запису - (4АА) - розширена бластоциста, ВКМ - щільно упакована з великою кількістю клітин, багато клітин формують трофектодерму.
допоміжний хетчінг
Незважаючи на те, що репродуктивна медицина в останні роки помітно «зробила крок вперед», далеко не у всіх випадках лікування безпліддя з першої спроби завершується настанням довгоочікуваної вагітності. Щоб підвищити ефективність проведених процедур, на сьогоднішній день розроблений ряд певних методик, що підвищують шанси на імплантацію зародка і подальше благополучне розвиток вагітності. Однією з таких методик є допоміжний хетчинг (від англ. To hatch out - «вилупитися з яйця»).
Людський зародок на ранніх стадіях свого розвитку оточений в блискучу прозору глікопротеїновими оболонку (латинська назва «zonae pellucidae»), що виконує роль захисної шкаралупи, яка забезпечує кортикальну реакцію, вибіркове надходження поживних речовин ембріону і дозволяє вберегти його від механічних пошкоджень. У процесі поділу клітин під дією особливих природних механізмів і ферментів вона стоншується і в певний час (зазвичай на 5-7 добу поділу) розривається і «сповзає», що дозволяє ембріону вийти з неї і успішно імплантуватися у внутрішню слизову оболонку матки - ендометрій.
Однак по ряду причин цей процес, як в природних умовах, так і в умовах ЕКО протікає правильно далеко не завжди, що перешкоджає подальшому настання вагітності. І саме таку проблему при проведенні екстракорпорального запліднення фахівці вирішують за допомогою допоміжного хетчинг - штучного надсеченная блискучої оболонки ембріона в умовах лабораторії. Це підвищує ймовірність імплантації зародка і подальшого прогресування вагітності за умови правильної підготовки ендометрія до прийняття заплідненої яйцеклітини.
На сьогоднішній день існує кілька методик проведення хетчинг, кожна з яких має свої особливості:
- Механічний хетчинг - механічний вплив на прозору оболонку ембріона і носить назву часткового розсічення. Спеціальної мікроголкою блискучу оболонку двічі проколюють під певним кутом, завдяки чому формується вузький проріз, через яку бластоциста може швидше вийти своєї блискучої оболонки.
- Хімічний хетчинг - вплив на оболонку спеціальним роз'їдаючим хімічним розчином (кислий розчин Тироде), який мікроінструменту наносять на її невелику область. В оболонці утворюється невеликий отвір діаметром 20 ± 7 мкм, після чого розчин прибирають, а зародок кілька разів промивають щоб уникнути шкідливого впливу агресивного речовини на його клітини.
- Хетчинг за допомогою лазерного випромінювання - виконується тонким лазерним променем, яким через оптичну лінзу безконтактним шляхом роблять надсечкі на оболонці (за допомогою наскрізного пошкодження або частіше локального її стоншування). Ця методика є точною, безпечною і ефективною, при цьому найбільш оптимальним її видом вважається застосування інфрачервоних променів діаметром 1480 нм.
- Пьезо-методика - здійснюється за допомогою п'єзоелектричного мікроманіпулятора, що має високочастотну мікровібрацію, залишає конічні поглиблення на обмеженій ділянці оболонки і тим самим сприяє її витончення.
Незважаючи на те, що допоміжний хетчінг вже багато років вважається рутинною процедурою, його доцільно застосовувати далеко не у всіх випадках проведення програм ДРТ. В одних випадках хетчинг є особливо актуальним, а в інших він ніяк не впливає на частоту настання вагітності.
Фахівцями встановлено ряд можливих показань до проведення даної маніпуляції в програмах ЕКЗ:
- вік жінки більше 38 років
- куріння
- кілька попередніх невдалих спроб ЕКО
- погані морфологічні показники ембріонів
- потовщена оболонка ембріона і інші її аномалії
- високий рівень фолікулостимулюючого гормону в крові
- перенесення ембріонів після кріоконсервації
У цих випадках методика допоміжного хетчинг може бути найбільш ефективна.