Ендоспори і інші покояться форми
До утворення ендоспор здатна тільки невелика група бактерій. Величезне значення ендоспор пов'язано з їх термостійкість. У той час як майже всі інші бактерії, а також вегетативні клітини спороутворюючих видів гинуть при 80 ° С (при температурі пастеризації) через 10 хв, терморезистентность ендоспори переносять значно більше сильне нагрівання; деякі суперечки витримують навіть кип'ятіння протягом багатьох годин. Трудомістка і дорога техніка сте-рілізаціі (знезараження) розрахована на знищення ендоспор. З іншого боку, терморезистентность суперечка надає своєрідну можливість виборчого збагачення культур спороутворюючих форм. Землю чи інший матеріал, взятий в певному місці, протягом 10 хв прогрівають при 80 або 100 ° С, що призводить до загибелі вегетативних клітин; тільки терморезистентность суперечки залишаються життєздатними і проростають у відповідній живильному середовищі.
Виявлення ендоспор. При мікроскопічному дослідженні суперечки видно завдяки своєму високому показнику заломлення - такого ж, як у зневодненого білка; це вказує на те, що в суперечках велика кількість багатого білком матеріалу сконцентровано в малому обсязі. Суперечки містить майже всі суху речовину материнської клітини, але займає в 10 разів менший обсяг. У сумнівних випадках питання про те, чи є в клітинах справжні ендоспори, можна вирішити за допомогою спеціального фарбування. Якщо препарат бактерій, фіксований нагріванням, прокип'ятити з карболовим розчином фуксину, то суперечки міцно пов'язують барвник і не знебарвлюються навіть при обробці етанолом або 1 М оцтовою кислотою, тоді як решта вмісту клітини при цьому стає безбарвним.
Спорообразование (споруляції). Спори утворюються всередині бактеріальної клітини. Цей процес починається з накопичення білкового матеріалу, тому показник заломлення в місці утворення суперечки зростає. Відбуваються при цьому метаболічні перетворення супроводжуються витрачанням запасних речовин (полі-3-гідроксимасляної кислоти у аеробів і полісахаридів у анаеробів). Протягом перших п'яти годин спорообразованія значна частина білків материнської клітини розпадається. При цьому утворюється специфічне для суперечка речовина - дипиколиновая (піридин-2,6-дикарбонових) кислота. У вегетативних клітинах ця кислота не зустрічається. В ході синтезу дипиколиновая кислоти відбувається поглинання іонів кальцію; в зрілих суперечках ця кислота знаходиться, мабуть, у вигляді хелати з кальцієм і може становити 10-15% сухої речовини суперечка. Дипиколиновая кислота локалізована в протопласті суперечки і є тільки в терморезистентность Ендоспори (рис. 2.45, 2.46).
Спорообразование - один з найскладніших процесів диференціювання бактеріальної клітини. Воно починається з особливого нерівного поділу клітини (рис. 2.45). В результаті впячивания плазматичноїмембрани частина протопласта отшнуровивается від материнської клітини. Цей протопласт містить частину ядерного матеріалу - один геном. Освіти клітинної стінки між обома протопластами (як при звичайному розподілі) тут не відбувається. Замість цього протопласт майбутньої суперечки оточується, як би обростає, плазматичноїмембраною материнської клітини. В результаті навколо нього виявляються дві плазматичні мембрани, і кожна з них бере участь у синтезі стінки суперечки. Мембрана протопласта суперечки синтезує зовні від себе стінку зародкової клітини, а мембрана, що повстає від материнської клітини, синтезує всередину кору суперечки (кортекс). Остання складається з багатошарового пептидоглікановому остова, який відрізняється від каркаса стінок вегетативних клітин крім іншого ступенем зшивання. Зовнішню оболонку суперечки утворює материнська клітина; ця оболонка в значній ча-сти складається з поліпептидів. Материнська ж клітина утворює ще один додатковий тонкий поліпептидний покрив - Екзоспори; він є тільки у небагатьох бактерій (наприклад, у Bacillus cereus) і оточує спору у вигляді вільного чохла. Зважаючи на таку багатошаровості покривів не покажеться дивним, що на частку оболонки доводиться близько половини обсягу і відповідно сухої маси зрілої суперечки.
Індукція спорообразованія. Спори аж ніяк не є обов'язковою стадією життєвого циклу бацил; при сприятливих умовах харчування бацили можуть необмежений час розмножуватися поділом як вегетативні клітини. Освіта суперечка починається лише тоді, коли не вистачає поживних речовин або коли в надлишку накопичуються продукти обміну. Іншими словами, воно відбувається лише в тих випадках, коли цьому сприяють загальні умови. Висихання не стимулює споруляцію. Якщо помістити вегетативні клітини в дистильовану воду, можна спостерігати «ендотрофную споруляцію», тобто утворення спор за рахунок накопичених всередині клітин запасних речовин. У таких випадках утворення спор, очевидно, викликається браком екзогенного субстрату. Індукція спорообразованія здійснюється в протягом не скількох годин. Якщо, наприклад, до суспензії вегетативних клітин Bacillus cereus var. mycoides в перші 5 годин після приміщення клітин в воду додати глюкозу, то утворення спор припиниться - додавання субстрату пригнічує споруляцію. Глюкоза, додана пізніше ніж через 6 ч, менш дієва: придушення спорообразованія не відбувається. Індукція (дерепресія) спорообразованія триває, і через 10-13 год після перенесення клітин в воду близько 90% їх утворює спори. Отже, споруляції регулюється зовнішніми факторами.
Число клітин, що утворюють спори, у багатьох випадках зростає після додавання до середовища солей марганцю.
Здатність утворювати ендоспори поступово втрачається при багаторазових пересіву вегетативних клітин. Оскільки суспензії спороутворюючих мікроорганізмів зазвичай містять і суперечки, і вегетативні клітини, перед кожним пересівом культуру, як правило, піддають короткочасного кип'ятіння. Це сприяє збереженню або підвищенню здатності клітин утворювати спори.
Радіорезистентність суперечка також вище, ніж у вегетативних клітин. Вона приблизно пропорційна вмісту дисульфідних груп в зовнішньому шарі білка. Оболонка спори містить головним чином білок, багатий цистеїном і нагадує кератин. Хімічна же стійкість ендоспор обумовлена непроникністю їх оболонки для багатьох речовин.
Проростання суперечка. У відповідних середовищах більшість суперечка проростає. Відповідна попередня обробка, певні умови зберігання і прогрів можуть підвищити «схожість» суперечка - збільшити відсоток проростання. У разі Bacillus subtilis оптимальними умови ми для стимуляції проростання суперечка вважають семиденний період спокою і п'ятихвилинний прогрів в воді при 60 ° С. Інші спори можуть бути активовані короткочасним кип'ятінням (10 хв при 100 ° С). Обробка тепловим шоком повинна проводитися безпосередньо перед висівом суперечка, так як процес активації звернемо. Проростанню спор передує поглинання ними води і набухання. Для проростання активованих суперечка в ряді випадків необхідна присутність глюкози, амінокислот, нуклеозидов або інших з'єднань. В ході проростання суперечка відбуваються глибокі фізіологічні зміни: дихання і ферментативна активність швидко зростають; починається виділення амінокислот, дипиколиновая кислоти і пептидів. При проростанні спор втрата сухої речовини досягає 25-30%. Під час проростання суперечки втрачають свою термостійкість. Вихідна з суперечки ростовая трубка буває оточена дуже тонкою і, мабуть, не повністю сформованої клітинною стінкою, так що в протопласт може, наприклад, проникати навіть ДНК. Ростова трубка може утворитися як в полярному, так і латеральному положенні; в одних випадках оболонка суперечки при цьому розривається, в інших ростовая трубка проколює її (рис. 2.47).
Тривалість життя суперечка. Бактерії у вигляді спор можуть дли тельное час перебувати в стані анабіозу. У землі, яка прилипла до рослин з гербарію Кью Гарденс (Англія) і пролежала разом з ними в сухому стані від 200 до 320 років, було виявлено лише невелика кількість життєздатних спор Bacillus subtilis і В. liche-niformis. У пробах ґрунту, що зберігалися від 50 до 100 років, були також про-дуть виявлені спори В. coagulans і В. circulans. За даними такого роду експериментів, в сухому грунті за 50 років зберігання до 90% суперечка втрачає життєздатність. Судячи з цього, одна тонна сухого ґрунту і через 1000 років все ще буде містити життєздатні спори.
У сухому стані багато бактерії (якщо не більшість з них) протягом ряду років зберігають життєздатність. Для консервації бактерій в колекціях вегетативні клітини піддають, як правило, ліофільної сушінні і зберігають при кімнатній температурі або при низьких температурах у вакуумі. Як розрахував ще Беккерель, мікроорганізми при температурі, близькій до абсолютного нуля, можуть залишатися життєздатними протягом мільйонів років. Короткочасні досліди з рідким азотом і екстраполяція їх результатів дозволяють зробити висновок, що такі припущення цілком виправдані. Бактерії, що не переносять лиофилизации, витримують багаторічна зберігання в суспензіях при температурі рідкого азоту.
Інші покояться форми (цисти, екзоспори, міксоспори). Ендоспори є тривалий час переживають формами бактерій, стійкими до високої температури, висихання, опроміненню і хімічних впливів. Крім ендоспор у деяких інших бактерій існують інші покояться форми - екзоспори і цисти. Освіта Екзоспори досі спостерігалося тільки у метаболизирующих метан бактерій Methylosinus trichosporium. Екзоспори виникають шляхом брунькування материнської клітини; вони подібні за своїми властивостями з Ендоспори бацил. Деякі бактерії утворюють кулясті товсто-стінні клітини, звані цистами. При виснаженні харчових ресурсів в цисту перетворюється вся паличкоподібна вегетативна клітина, а не тільки частина її, як при утворенні ендоспори. Цисти видів Azotobacter, а також Methylocystis стійкі до висушування, механічних навантажень і опроміненню, але не до дії високих температур. Подібного роду перетворення всієї клітини в цисту лежить і в основі освіти міксоспор з паличковидних вегетативних клітин Myxococcus і Sporocytophaga.
Клітини Arthrobacter (A. globiformis) плеоморфние. При великій кількості субстрату вони ростуть у вигляді паличок; коли ж субстрат висихає, з'являються кокковидной клітини. Arthrobacter відноситься до тих бактеріям, які здатні деякий час зберігатися в висохлої грунті, пре буваючи в стані спокою; структурної диференціювання в даному випадку не виявлено.