Спонсор конкурсу - далекоглядна компанія Life Technologies. Спонсор призу глядацьких симпатій - фірма Helicon.
М'ячі для нанофутболістов
Фулерени - це досить незвичайний клас молекул, які представляють собою одну з форм існування вуглецю (так званих аллотропних модифікацій). Всім відомі алмаз і графіт - теж не що інше, як різні аллотропние форми вуглецю, проте в структурі алмазу атоми вуглецю зібрані в тетраєдри, графіт складається з плоских шарів, утворених шестикутниками, ну а фулерени це кулясті молекули з замкнутою поверхнею. Найпростіший з фулеренів містить 60 атомів вуглецю і дивним чином нагадує за своєю структурою футбольний м'яч: його поверхня утворена чергуються п'яти- і шестикутниками, причому розмір цього «м'яча» становить всього 1 нм (нанометр).
Малюнок 1. Молекула фулерену дуже схожа на футбольний м'яч, тільки забивати їм голи зможе лише футболіст наноскопіческіх розміру.
Відкриття фулеренів - один з яскравих прикладів прогностичної мощі науки: ще в 70-і роки XX століття були зроблені теоретичні квантово-хімічні розрахунки, що пророкують існування подібних молекул, проте лише в 1985 році їх вперше виявили при дослідженні парів графіту після його лазерного опромінення [1 ]. Пізніше фулерени були знайдені і в природних мінералах - особняком тут коштує такий камінь, як шунгіт [2]. А недавно з'ясувалося, що ці вуглецеві «кульки» зустрічаються навіть в космічних туманностях [3].
Фізики і хіміки знайшли фуллеренам безліч застосувань: їх використовують при синтезі нових сполук в оптиці і при виробництві провідників. Про біологічних ж властивості фулеренів довгий час надходили неоднозначні дані: біологи то оголошували їх токсичними [4]. то виявляли антиоксидантні властивості фулеренів і пропонували використовувати їх в лікуванні таких серйозних захворювань, як бронхіальна астма [5].
Щури-довгожителі
Ці речовини є ліпофільні позитивно заряджені молекули з приєднаним антиоксидантну «хвостом», які завдяки своїй структурі здатні накопичуватися в мітохондріях (саме в цих органелах еукаріотичних клітин відбувається генерація активних форм кисню). Однак з'єднання ряду SkQ продовжували життя піддослідних мишей в середньому всього на 30%.
Малюнок 2.Слева - миша, старіння якій загальмовано завдяки прийому «іонів Скулачева», праворуч - миша з контрольної групи [11].
Чому ж фулерени виявилися настільки ефективними в боротьбі зі старінням?
Поставивши собі за цим питанням, ми стали розглядати можливість існування додаткового механізму біологічної дії фулеренів - крім уже відомого антиоксидантної. Підказка виявилася при вивченні одного із з'єднань ряду SkQ - SkQR1, що містить залишок родаміну. Це з'єднання належить до групи протонофоров - молекул, здатних переносити протони з межмембранного простору через мембрану в матрикс мітохондрії, знижуючи, таким чином, трансмембранний потенціал (Δψ). Як відомо, саме цей потенціал, який існує завдяки різниці у змісті протонів по різні боки мембрани, і забезпечує вироблення енергії в клітині. Однак він же і є джерелом генерації АФК. По суті, активні форми кисню тут те саме «токсичним відходам» при виробництві енергії. Хоча вони мають і ряд корисних функцій [12]. в основному АФК - джерело пошкодження ДНК, ліпідів і багатьох внутрішньоклітинних структур.
Малюнок 3. Схема будови мітохондрії (зліва), перенесення протонів органічними кислотами - «м'якими роз'єднувача» (в центрі) - і динитрофенол - найвідоміший з «разобщітелей» (праворуч).
Є відомості, що деяке зниження мітохондріального трансмембранного потенціалу може бути корисним для клітин [13]. Зниження його всього на 10% призводить до зменшення продукції АФК в 10 разів [14]. Існують так звані «м'які разобщители», що підвищують протонну провідність мембран, в результаті чого відбувається «роз'єднання» дихання і фосфорилювання АТФ [15].
Мабуть, найвідоміший «разобщитель» - DNF, або 2,4-динитрофенол (рис. 3). У 30-ті роки ХХ століття їм дуже активно користувалися при лікуванні ожиріння. Власне, динитрофенол - перший «жиросжигатель», який використовували в офіційній медицині. Під його дією клітка перемикається на альтернативний шлях метаболізму, запускаючи «спалювання» жирів, а одержувана кліткою енергія не запасається в АТФ, як зазвичай, а випромінюється у вигляді тепла.
Пошук легких способів схуднення буде актуальним завжди, поки представники Homo Sapiens будуть турбуватися про свій зовнішній вигляд; однак для нашого дослідження більш цікавим є той факт, що подібні «м'які разобщители» знижують вироблення АФК і в невеликих дозах можуть сприяти продовженню життя [16].
Виникає питання - а чи можуть фулерени, крім антиоксидантних властивостей, проявляти ще і властивості «переносників» протонів, діючи, таким чином, відразу з двох сторін? Адже куляста молекула фулерену - порожниста зсередини, а значить, в ній цілком можуть вміститися невеликі частинки - такі як протони.
Моделювання in silico. що зробили фізики
Для перевірки цієї гіпотези колективом НОЦ «нанорозмірних структура речовини» були виконані складні розрахунки. Як і в історії з відкриттям фуллерена, в нашому дослідженні комп'ютерне моделювання передувало експериментів. Моделювання можливості проникнення протона в фулерен і розподілу заряду в такій системі вироблялося на основі теорії функціонала щільності (DFT). Це широко використовуваний інструмент квантово-хімічних розрахунків, що дозволяє обчислювати властивості молекул з високою точністю.
При моделюванні один або кілька протонів поміщали поза фуллерена, а потім проводився розрахунок найбільш оптимальної конфігурації - такий, при якій повна енергія системи буде мінімальною. Результати розрахунків показали: протони можуть проникати всередину фулерену! Виявилося, всередині молекули C60 може накопичуватися до шести протонів одночасно, а ось сьомий і наступні вже не зможуть проникнути всередину і будуть відштовхуватися - справа в тому, що «заряджений» протонами фуллерен набуває позитивний заряд (а, як відомо, однойменно заряджені частинки відштовхуються) .
Малюнок 4. Розподіл позитивного заряду всередині системи «фуллерен + протони» .Слева направо: два, чотири або шість протонів всередині фулерену. Кольором позначено розподіл заряду: від нейтрального (червоний) до слабопозитивного (синій).
Відбувається це тому, що проникають всередину фуллеренового «кульки» протони відтягують на себе електронні хмари атомів вуглецю, що призводить до перерозподілу заряду в системі «протони + фуллерен». Чим більше протонів проникає всередину, тим сильніше позитивний заряд на поверхні фулерену, тоді як протони, навпаки, все більше наближаються до нейтральних значень. Цю закономірність можна простежити і на малюнку 4: коли кількість протонів всередині сфери перевищує 4, вони стають нейтральними (жовто-оранжевий колір), ну а поверхня фуллерена все сильніше «синіє».
Спочатку розрахунки були виконані тільки в системі «фуллерен + протони» (без урахування впливу інших молекул). Але ж в клітці фуллерен знаходиться не в вакуумі, а у водному середовищі, заповненої безліччю з'єднань різного ступеня складності. Тому на наступному етапі моделювання фізики додали до системи 47 молекул води, що оточують фуллерен, і перевірили, чи не вплине їхня присутність на взаємодію з протонами. Однак і в присутності води модель діяла успішно.
Біологи підтверджують гіпотезу?
Для вивчення антиоксидантних властивостей фулеренів ми використовували систему експрес-тестів на основі біолюмінесцентних бактеріальних біосенсорів. Біосенсори в даному випадку - генетично-модифіковані бактерії, здатні вловлювати підвищення внутрішньоклітинної генерації АФК і «сигналізувати» про це дослідникам. При створенні біосенсорів в генóм одного з нешкідливих штамів кишкової палички Escherichia coli вводиться штучна конструкція, що складається з генів люмінесценції (світіння), поставлених під контроль специфічних промоторів - регуляторних елементів, «включаються» при підвищенні внутрішньоклітинної генерації активних форм кисню, або ж при дії інших стрес-факторів - наприклад, при пошкодженні ДНК. Варто почати діяти на клітину таким стрес-фактором - бактерія починає світитися, і за рівнем цього світіння можна з достатньою точністю визначити рівень пошкоджень.
Малюнок 5. Сяючі бактерії на чашці Петрі (зліва) і принцип дії біосенсорів (праворуч).
Такі модифіковані штами розробляються в ДержНДІ Генетики [19] і широко застосовуються в генетичній токсикології [20] при вивченні механізмів дії випромінювань і окисного стресу [21]. дії антиоксидантів (зокрема, SkQ1 [22]), а також для пошуку нових перспективних антиоксидантів серед синтезованих хіміками речовин [23].
У нашому випадку використання саме бактеріальної моделі пов'язано з наступним: бактерії, як відомо, відносяться до прокаріотів, і клітини їх влаштовані простіше, ніж еукаріотичні. Процеси, що відбуваються в мембрані мітохондрій еукаріот, у прокаріотів реалізуються прямо в клітинній мембрані; в цьому сенсі бактерії - «самі собі мітохондрії». (Дивовижна схожість будови цих органел з бактеріями навіть послужило свого часу основою для так званої симбиотической теорії походження еукаріот [24].) Отже, для вивчення процесів, що відбуваються в мітохондріях, подібна модель цілком підходить.
Перші ж результати показали, що водна суспензія фулерену C60. для більш ефективного розчинення оброблена ультразвуком, при додаванні до культури біосенсорів збільшувала їх стійкість до пошкодження ДНК активними формами кисню. Рівень таких пошкоджень в досвіді був на 50-60% нижче, ніж в контролі.
Крім того, було зафіксовано зниження рівня спонтанної продукції супероксид-аніон-радикала в клітинах SoxS-lux штаму при додаванні суспензії C60. Особливістю цього штаму якраз і є зв'язок рівня його світіння з кількістю супероксид-аніон-радикала. Саме такого ефекту слід очікувати від з'єднання, що діє за принципом «м'яких разобщітелей» - якщо знижується трансмембранний потенціал, то і АФК (зокрема, супероксид) будуть вироблятися в менших кількостях.
Отримані результати, звичайно, дуже попередніми, і роботи ще тривають, саме тому в підзаголовку даного розділу і стоїть знак. Час покаже, чи зможемо ми з часом замінити його на впевнений знак. Ясно одне - найближчим часом фулерени неминуче виявляться в фокусі уваги наукових колективів, які вивчають проблеми старіння і займаються пошуком геропротекторов - речовин, що уповільнюють старіння. І хто знає, чи не стануть ці крихітні «кульки» надією на продовження такої короткої поки людського життя?
Робота проводилася в лабораторії експериментального мутагенезу та лабораторії промислових мікроорганізмів НДІ біології ПФУ, а також в НОЦ «нанорозмірних структура речовини», ПФУ, під керівництвом проф. А.В. Солдатова. Основні результати моделювання системи «фуллерен + протони» і біологічні ефекти описані, відповідно, в роботах: