Генна інженерія рослин за допомогою agrobacterium

Безпосередній перенесення гена в чужорідний геном отримав назву генетична трансформація. Система, що забезпечує таке перенесення, отримала назву вектор.

Плазмідні вектори. Як векторів використовуються плазміди бактерій і для трансформації рослин найчастіше Ti - плазміда (від англ. Tumor induction) грунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens. У природних умовах Agrobacterium tumefaciens проникають в клітини коренів рослин і там розмножуються. При цьому частина плазмідної ДНК (T-ДНК) вбудовується в хромосоми пошкоджених (заражених) клітин, індукуючи утворення галлів (пухлин). Це природний вектор перенесення ДНК. При трансформації рослин використовують так звану зруйновану Ti-плазміди, яка позбавлена ​​онкогенов, що викликають утворення галлів. Замість цих генів в плазміду # 8213; вбудовують цікавлять дослідника гени, а також так звані репортерного гени, що дозволяють переконатися у вбудовуванні T-ДНК в геном рослини, в результаті експрес яких, трансформована клітина стає стійкою до антибіотиків канаміцину, метатрексіату і гігроміціну В.

При культивуванні трансформовані клітин на середовищі з даними антибіотиком, виживають тільки клітини, у яких Т-ДНК включена в геном. Крім # 8213; вбудованих генів Ti-плазміда повинна містити гени vir-областей, які забезпечують сам процес вбудовування T-ДНК в хромосому. В подальшому було створено, так звана, бінарна система трансформації, що складається з невеликої, реплицирующейся як в E.coli, так і в A.tumefaciens, плазміди, що несе переносяться гени, і Ti-плазміди, що несе vir-гени з делетірованной Т-ДНК . Вважається, що з використанням A.tumefaciens легше трансформувати дводольні рослини (горох, тютюн і т.п.), ніж однодольні (пшениця, кукурудза). Але це вже залежить від обраного методу трансформації. Взагалі ж на сьогодні створено величезну кількість плазмід, які використовуються в якості векторів при трансформації як рослин, так і тварин.

Вірусні вектори. З метою трансформації рослин використовують і вектори, сконструйовані на основі рослинних вірусів. Однак їх набір обмежений. Це пояснюється тим, що у більшості рослинних вірусів генетичним матеріалом є РНК, і тільки у деяких, як вірус мозаїки цвітної капусти (СаМV) і групи вірусів Gemini, спадковим матеріалом служить ДНК. Недоліком вірусних векторів є обмежена протяжність вбудованих генів (від 200 до 500 п.н.) і висока специфічність по відношенню до видів рослин. Так, вірус мозаїки цвітної капусти можна використовувати тільки при трансформуванні рослин, що відносяться до сімейства хрестоцвітних.

Генна гармата. Цей метод носить назву «біологічної балістики». Він полягає в обстрілі з вакуумної гармати (генна гармата) суспензій клітин рослин, протопластів і каллусов. Обстріл рослинних тканин виробляють частинками золота або вольфраму (діаметр 0,6 - 1,2 мкм), на які нанесена чужорідна ДНК. Рослинні клітини мають у своєму розпорядженні на спеціальній целофановій пластині. Частинки металу пронизують клітини, залишаючи в них ДНК. Трансформується при цьому близько 10-15% клітин, частина з яких регенерує в нормальні рослини. І хоча процес трансформації все ж носить випадковий характер, до теперішнього часу цим способом отримані трансгенні рослини, переважно з однодольних культур (кукурудза, рис, пшениця та ін.).

Метод електропорації. Це один з методів прямого введення ДНК в клітину. Рослинні клітини занурюють в середу з розташованої в ній чужорідної ДНК. Через цю середу пропускають (частки секунди!) Електричний струм з напругою 250-300 В. Через розширилися пори ядерної мембрани чужорідна ДНК проникає в ядра і включається в хромосоми.

Мікроін'єкції. За допомогою мікроголки (зовнішній діаметр 2 мкм) чужорідну ДНК вводять в ядра клітин, закріплених на склі за допомогою полілізину.

Використання «агентів злиття». Як «агентів злиття» використовують позитивно заряджені сфери ліпідів (ліпосоми), які обволікають векторну ДНК, захищаючи її від дії нуклеаз. Що знаходиться в ліпосоми ДНК проникає з їх допомогою в рослинні клітини і включається в геном.

Схожі статті