Актуальність розробки нових вакцин
Використовувані сьогодні вакцини можна розділити в залежності від методів їх отримання на наступні типи:
• живі аттенуіровані вакцини;
• інактивовані вакцини;
• вакцини, що містять очищені компоненти мікроорганізмів (протеїни або полісахариди);
• рекомбінантні вакцини, що містять компоненти мікроорганізмів, отримані методом генної інженерії.
Технологію рекомбінантної ДНК застосовують також для створення живих ослаблених вакцин нового типу, досягаючи аттенуации шляхом спрямованих мутацій генів, що кодують вірулентні протеїни збудника захворювання. Цю ж технологію використовують і для отримання живих рекомбінантних вакцин, вставляють гени, що кодують імуногенні протеїни, в живі непатогенні віруси або бактерії (вектори), які і вводять людині.
Мал. 1. Одноразовий генний пістолет компанії «Powderject»
а - зовнішній вигляд; б - в розрізі
Для отримання ДНК-вакцин ген, який кодує продукцію імуногенною протеїну будь-якого мікроорганізму, вбудовують в бактеріальну плазміду. Плазміда являє собою невелику стабільну молекулу кільцевої дволанцюгової ДНК, яка здатна до реплікації (відтворення) в бактеріальної клітці. Крім гена, що кодує вакцинують протеїн, в плазміду вбудовують генетичні елементи, які необхідні для експресії ( «включення») цього гена в клітинах еукаріотів, в тому числі людини, для забезпечення синтезу білка. Таку плазмиду вводять в культуру бактеріальних клітин, щоб отримати велику кількість копій. Потім плазмидную ДНК виділяють з бактерій, очищають від інших молекул ДНК і домішок. Очищена молекула ДНК і служить вакциною. Введення ДНК-вакцини забезпечує синтез чужорідних протеїнів клітинами вакцинируемого організму, що призводить до подальшої виробленні імунітету проти відповідного збудника. При цьому плазміди, що містять відповідний ген, не вбудовуються в ДНК хромосом людини.
Мал. 2. Багаторазовий генний пістолет компанії «Powderject»
а - змінний картридж; б - прилад в повній збірці
Наступні експерименти підтвердили здатність ДНК-вакцин формувати імунітет щодо різноманітних збудників.
Потенційні переваги ДНК-вакцин
ДНК-вакцини мають ряд переваг в порівнянні з традиційними вакцинами.
I. Підвищення ефективності та безпеки імунізації
1. Сприяють виробленню антитіл до нативної молекулі вірусних протеїнів.
Якщо в якості вакцини використовувати імуногенні протеїни, то в процесі їх виробничого отримання і очищення можуть відбутися зміни тривимірної конфігурації цих молекул. Тому імунізація може бути низькоефективної в зв'язку з утворенням антитіл, специфічних до змінених імуногенні молекулам, але не до нативним вірусним протеїнів. Введення ДНК-вакцин, як правило (див. «Можливі обмеження в застосуванні ДНК-вакцин»), призводить до синтезу клітинами вірусних антигенів в їх нативної формі.
2. Сприяють виробленню цитотоксичних Т-лімфоцитів.
Інактивовані або суб'едінічние вакцини в основному індукують гуморальну імунну відповідь. Це обумовлено тим, що характер механізмів подання і розпізнавання антигенів клітинами імунної системи залежить від того, синтезується чи антиген в клітці або надходить в неї ззовні. А від цього в свою чергу залежить характер активації та взаємодії клітин, що беруть участь в імунній відповіді. Оскільки ДНК-вакцини забезпечують синтез іммунногенность білків клітинами самого організму, вони сприяють формуванню як гуморального, так і клітинного імунітету. Активація цитотоксичних Т-клітин без введення живого патогена є найважливішою відмінною рисою ДНК-вакцин.
3. Чи можуть вибірково впливати на різні субпопуляції Т-лімфоцитів.
В принципі можлива розробка ДНК-вакцин, які вибірково активують різні типи хелперних Т-лімфоцитів. Завдяки цьому можуть бути створені генні вакцини для лікування осіб з аутоімунними або алергічними захворюваннями, патогенез яких пов'язаний з порушенням різних ланок імунної регуляції.
4. Сприяють формуванню тривалого імунітету.
Як і живі аттенуіровані, ДНК-вакцини здатні забезпечувати імунітет протягом тривалого часу. Цим вони відрізняються від інактивованих вакцин, які забезпечують тривалий імунітет тільки шляхом проведення повторних вакцинацій.
5. Усувають ризик інфікування.
За своєю дією ДНК-вакцини нагадують живі аттенуіровані вірусні вакцини або деякі рекомбінантні вакцини на основі живих вірусних векторів, так як імуногенні білки синтезуються в організмі самої людини. Але при введенні генних вакцин відсутня небезпека інфікування людини.
II. спрощення розробки
і виробництва нових вакцин
1. Простота отримання великої кількості ДНК-патогенних мікроорганізмів.
Багато мікроорганізмів складно культивувати (віруси гепатиту В і С, папіломи людини та ін.), Що ускладнює створення вакцин. Завдяки сучасним технологіям (наприклад, застосування полімеразної ланцюгової реакції) можна отримати достатню кількість ДНК практично будь-якого патогенного мікроорганізму, виділити гени, що кодують імуногенні протеїни, і створити вакцину. Виконання Проекту людського генома призведе до того, що через кілька років вчені будуть розташовувати розшифрованими геномами більшості відомих патогенних мікроорганізмів. Це значно полегшить завдання скринінгу генів для ідентифікації тих з них, які кодують молекули імуногенних протеїнів збудника захворювання. У тих випадках, коли такі гени важко виявити, розробники вакцин можуть скористатися «бібліотеками ДНК» відповідних патогенів (колекціями послідовностей комплементарної ДНК, що містять тільки ті ділянки ДНК будь-якого мікроорганізму, які кодують продукцію білків, тобто все експресовані гени). Ці молекули ДНК легко клонувати і використовувати в дослідженнях зі створення вакцин.
2. Можливість створення комбінованих вакцин.
Як комбінованих вакцин зараз широко застосовують тільки інактивовані вакцини, оскільки при введенні декількох аттенуірованних вірусних вакцин вони можуть втрачати імуногенність (так званий феномен вірусної інтерференції). ДНК-вакцини можна комбінувати. Це особливо важливо, тому що в даний час дітям з 1-го тижня життя і до 16-18 років виконують не менше 18 вакцинацій. Мультівалентние ДНК-вакцини можна використовувати для вироблення ефективного імунітету проти паразитарних захворювань (так як антигенні характеристики паразита можуть залежати від стадії його розвитку в організмі людини), а також для боротьби з лікарсько-стійкими формами мікроорганізмів.
3. Спрощення виробництва вакцин.
Технології виробництва більшості застосовуваних сьогодні вакцин надзвичайно різноманітні і багато в чому залежать від особливостей збудника захворювання, проти якого розроблена вакцина. Навпаки, технологія отримання різних ДНК-вакцин істотно не відрізняється. ДНК-вакцини відрізняються тільки генами, які включені в плазміду. Генні вакцини можна віднести до субодиничних вакцинам, оскільки вони призводять до синтезу одного або декількох імуногенних білків в організмі людини. Однак методи створення «класичних» субодиничних вакцин, як і рекомбінантних субодиничних вакцин на основі застосування вірусних векторів, значно складніше. Використання єдиної технології може істотно спростити стандартизацію методів виробництва ДНК-вакцин і контролю їх якості. Крім того, це дозволить скоротити витрати на їх виробництво.
III. спрощення вимог
до умов зберігання
1. Висока стабільність вакцин.
ДНК-вакцини високостабільного. Вони здатні витримувати низькі і високі температури (трохи нижче температури кипіння води) і різні умови вологості. Тому генні вакцини не вимагають створення так званих холодових ланцюжків (необхідність зберігання вакцин в холодильних установках на всьому шляху від місця виробництва до кінцевого споживача). Це якість дає їм значні переваги перед іншими вакцинами, так як в деяких країнах, що розвиваються на підтримку холодових ланцюжків припадає близько 80% вартості проведення однієї вакцинації. Таким чином, вартість транспортування і зберігання ДНК-вакцин буде значно нижче.
Можливі обмеження в застосуванні ДНК-вакцин
Оскільки гени кодують синтез білкових молекул, то ДНК-вакцини сприяють формуванню імунітету тільки щодо протеїнових компонентів хвороботворних мікроорганізмів. Тому вони не можуть замінити вакцини, дія яких заснована на використанні інших антигенних молекул, наприклад капсулярних антигенів, представлених полісахариди (полісахаридні пневмококові, менінгококової, черевнотифозні вакцини і ін.).
Інше обмеження пов'язане з тим, що молекули білків після синтезу часто зазнають в клітці подальші біохімічні зміни, наприклад піддаються Глікозилювання. Ці процеси в клітинах людини, тварин і мікроорганізмів можуть протікати по-різному. Тому існує ймовірність того, що структура антигенного протеїну, синтезованого в клітинах людини, буде відрізнятися від структури натурального імуногенною вірусного протеїну. Результати проведених експериментів поки не підтвердили цих побоювань.
Крім того, недостатньо добре вивчені особливості перорального або інтраназального застосування ДНК-вакцин. Тим часом, слизові оболонки є воротами інфекції для багатьох збудників захворювань і відомо, що для ряду патогенних мікроорганізмів найбільш ефективним методом імунізації є ініціація імунної відповіді в місці інфікування.
Питання безпеки застосування
Існують побоювання, що молекула ДНК-плазміди може вбудовуватися в ДНК хромосом людини, що призведе до мутації гена на цій ділянці. Однак експерименти на мишах свідчать, що інтеграція плазміди в ДНК мишей спостерігається приблизно в 1000 разів рідше, ніж спонтанні мутації генів.
Відомо також, що імунологічна толерантність (нездатність до імунної відповіді на антиген) може бути викликана повторним введенням дуже низьких доз антигену. При імунізації за допомогою ДНК імуногенний протеїн також синтезується в організмі в невеликій кількості протягом тривалого часу. Ця проблема вимагає більш ретельного вивчення, але, мабуть, не є суттєвою перешкодою в зв'язку з можливістю регулювання кількості введеної ДНК і відповідно числа клітин, що синтезують антигенний білок.
Висловлювалося припущення, що введення ДНК-вакцин може призводити до розвитку аутоімунних захворювань в результаті імунної реакції, спрямованої проти клітин організму людини, що експресують антигенний протеїн, або внаслідок утворення антитіл до чужорідної ДНК. Однак проведені експерименти дозволяють сподіватися, що введення ДНК-вакцин не підвищує ризик розвитку аутоімунних реакцій, у всякому разі в порівнянні з вживаними в даний час аттенуированного вірусними вакцинами.
Участь фармацевтичних компаній у розробці ДНК-вакцин
Усвідомлення перспективності застосування генних вакцин сприяло значному збільшенню фінансування досліджень в цьому напрямку не тільки з боку державних організацій, а й приватних компаній.
Аналогічним чином розвивається співпраця компаній «Glaxo Wellcome» і компанії «Powderject» в області розробки ряду профілактичних і терапевтичних ДНК-вакцин.
ДНК-вакцини мають великий потенціал і можуть викликати революцію в вакцинологии. Однак багато фахівців не поспішають робити остаточні висновки до тих пір, поки не отримають достатню кількість даних клінічних досліджень, переконливо свідчать про ефективність і безпеку ДНК-вакцин. У найближчі кілька років не слід очікувати їх впровадження в медичну практику, оскільки більшість з розроблюваних вакцин знаходиться на етапі доклінічних або проходять I-II фазу клінічних досліджень.