Імуногістохімічні методики дослідження, автор селезньов а

Невелику ділянку антигену, з яким буде зв'язуватися антитіло, називається епітопом. Зазвичай в епітоп входить від однієї до шести молекул моносахаридів або амінокислот, розташованих на поверхні антигену. Через те, що всі високомолекулярні речовини мають певну форму в просторі, саме просторові взаємини грають головну роль у взаємодії «антиген-антитіло», тобто антитіло має «підходити» до антигену як ключ до замка. Такий вид епітопи називають «конформаційним». Рідше специфічність епітопи визначається тільки первинною структурою молекули, тобто послідовністю його складових, такий епітоп називають «лінійним». Кількість можливих місць зв'язування величезна, кожне таке місце унікальне, його структура залежить від ковалентних, водневих зв'язків, гідрофільних і гідрофобних взаємодій всередині молекули.
Важливим етапом будь-якого иммуногистохимического методу є візуалізація результатів реакції «антиген-антитіло». Виявити антитіла, зв'язалися з антигеном, можна використовуючи різні мітки, пов'язані з Fc-фрагментом антитіл. Такими позначки можна використати:
  • флюорохромами;
  • ферменти;
  • метали і Металопротеїни;
  • радіоізотопи;
  • проміжні сполучні речовини, наприклад, біотин, дигоксин, дігоксігенін.

    Дані мітки можуть бути кон'юговані як з первинними антитілами, так і з вторинними. Якщо мітка Кон'юговані з первинними антитілами (рис.1, А), то такий метод візуалізації називається прямим. Це найбільш простий метод візуалізації, проте чутливість його вкрай низька, так як на одну молекулу шуканого антигену припадатиме одна мітка. Чутливість методу була набагато підвищена після винаходу непрямого методу: первинні антитіла не несли на собі ніякої мітки, мітку несли вторинні антитіла (рис.1, Б), для яких первинні антитіла є антигеном. Наприклад, якщо первинні антитіла отримані від мишей, то вторинними можуть бути кролячі, специфічні для Fc-фрагмента мишачих імуноглобулінів. І хоча в реакцію додається ще один етап, такий метод має деякі переваги:
  • вторинні антитіла проти Fc-фрагмента іншого виду тварини отримувати набагато простіше, також легше приєднати до них мітку;
  • первинні антитіла не несуть на собі зайвого вантажу, а значить, легше і швидше проникають в тканини, мітка не впливає на конформаційні зміни після взаємодії антитіл з антигеном.

    Як міток спочатку використовували різні флюорохромами. У таблиці 1 представлені найбільш часто використовувані флюорохромами. Все флюорохромами мають здатність випромінювати світло у видимому діапазоні спектра при освітленні їх світлом з певною довжиною хвилі (табл.1).
    Однак, флюоресцентні мітки мають свої недоліки:
  • необхідність спеціального флуоресцентного мікроскопа з набором бар'єрних фільтрів;
  • низька чутливість методу;
  • складність підготовки препаратів;
  • швидке загасання флюоресценції, навіть при використанні реагентів, що знижують даний ефект (наприклад, дігидрохлоріда 2- (4-амідінофеніл) -6-індолкарбаміна (DAPI);
  • отримані препарати не можна зберігати.

    Тому в подальшому були розроблені методи отримання стабільних забарвлень, щоб препарати можна було досліджувати за допомогою звичайної світлової мікроскопії і довго зберігати.
    Найбільш простий міткою для отримання препаратів з тривалим терміном зберігання є метали, наприклад, колоїдне золото. В результаті реакції «антиген-антитіло» в місці скупчення антитіл в світловому мікроскопі виявляється фарбування в темний колір. Довгий час мічені металами антитіла використовувалися рідко через низьку чутливості, однак в 1989 році чутливість була підвищена в 100 раз за допомогою методу посилення сріблом і мікроскопії в поляризованому світлі [7]. У рідкісних випадках використовуються антитіла, мічені важкими металами для подальшого електронно-мікроскопічного дослідження препаратів.
    Радіоізотопи також використовуються дуже рідко через високу небезпеку опромінення персоналу. Мічені радіоактивними мітками антитіла в даний момент використовуються тільки для досліджень на живих культурах клітин. Після обробки культури тканини антитілами з радіоактивними мітками за ступенем випромінювання можна судити про кількість шуканого антигену в тканинах.
    Найбільшого поширення набули ферментні мітки [4]. Одна молекула ферменту, кон'юговані з антитілом, здатна «обробити» велику кількість молекул субстрату, що утворився нерозчинний барвник накопичується в тканині навколо фіксованого до антигену антитіла.
    Таблиця 1. Характеристики найбільш часто використовуваних флюорохромів.

    Імуногістохімічні методики дослідження, автор селезньов а

    Імуногістохімічні методики дослідження, автор селезньов а

    Рис 1. Прямий і непрямий метод візуалізації

    А - первинне антитіло проти антигену містить мітку, наприклад, флюорохром. Б - первинне антитіло проти антигену не має мітки, після інкубації з первинним антитілом додають вторинне антитіло, яке з'єднується з первинним. Мітка знаходиться на вторинному антитілі.

    Імуногістохімічні методики дослідження, автор селезньов а

    Рис 2. Кінцевий комплекс, що утворюється при РАР-методі.

    Первинне антитіло і антитіло проти пероксидази в РАР-комплексі повинні бути отримані від тварин одного і того ж виду.
    Найбільшого поширення в якості ферментної мітки отримали пероксидаза хрону, яку вперше застосували Накане і Пірс, лужна фосфатаза і глюкозоксидаза. Для кожного із зазначених ферментів існує кілька субстратів, які під дією ферменту утворюють нерозчинні фарбники різного кольору. Можливі поєднання ферментів і субстратів підсумовані в таблиці 2.
    Необхідно пам'ятати, що пероксидаза і лужна фосфатаза є і в тканинах організму, тому іноді можна отримати хибнопозитивні результати [2,3]. Пероксидаза міститься у великій кількості в нейтрофілах і еозинофілів, тому для фарбування мазків крові, кісткового мозку і зрізів імунокомпетентних органів використання цього ферменту не рекомендується. При фарбуванні інших тканин невелика пероксидазна активність блокується додаванням перекису водню перед інкубацією з первинними антитілами. Лужна фосфатаза міститься в багатьох тканинах, тому під час інкубації з субстратом в нього додають левамизол, однак треба пам'ятати, що лужна фосфатаза кишечника і плаценти не пригнічує левамизолом, тому для цих тканин краще використовувати інші ферменти. Глюкозоксидаза може використовуватися без обмежень при фарбуванні будь-яких тканин, тому що в тканинах ссавців немає такого ферменту.
    Відкриття ферментних міток стало великим кроком вперед при розробці иммуногистохимических технологій, проте всі проблеми не були вирішені. При дослідженні антигенів, які містяться в невеликій кількості в клітинах (наприклад, рецепторів до гормонів на клітинної поверхні, іонних каналів) чутливість даних систем була явно недостатньою.
    Наступним кроком у розвитку систем візуалізації стали системи з використанням антитіл проти пероксидази і лужної фосфатази (PAP і APAAP-комплекси). Послідовність процедури наступна. 1 етап: спочатку наносяться первинні антитіла; 2 етап: наносяться вторинні антитіла проти первинних (сполучна антитіло), при цьому один з антигензв'язуючих ділянок вторинних антитіл зв'язується з первинним антитілом, а другий залишається вільним; 3 етап: вносяться антитіла проти пероксидази або лужної фосфатази, отримані від тварини того ж виду, від якого отримані первинні антитіла, антигензв'язуючих ділянки якого зайняті відповідним ферментом. Ці антитіла зв'язуються з другим антигензв'язуючих ділянкою вторинних (сполучних) антитіл. Таким чином, формується комплекс, де з одним антигеном виявляються пов'язаними вже 2 молекули ферменту (рис.2), що збільшує чутливість методу в 2 рази.
    Справжнім проривом стала розробка в 1979 році методу непрямого іммуноокрашіванія з використанням біотин-авідінового комплексу [5,6].
    Таблиця 2. Ферменти, що використовуються в імуногістохімічних методиках, і відповідні їм субстрати.

    Імуногістохімічні методики дослідження, автор селезньов а

    Імуногістохімічні методики дослідження, автор селезньов а

    Рис 3. Кінцевий комплекс при АВС-метод

    Комплекс формується в три етапи. На першому етапі немічених первинні тіла з'єднуються з антигеном, на другому етапі мічені біотином вторинні антитіла з'єднуються з первинними, на третьому додається комплекс авидин-біотин-фермент, який приєднується до біотину вторинних антитіл.
    Біотин є вітаміном H, нижче приведена його хімічна формула:

    Біотин - з'єднання, стійке до дії високих температур, до кислої і лужної середовищі, добре розчиняється у воді і спирті. Він є коферментом у багатьох реакціях приєднання (карбоксилювання). Біотин легко може вступати в стійке з'єднання з різними білками, в тому числі з ферментами і імуноглобулінами. У великій кількості біотин міститься в білках пташиних яєць, де він пов'язаний з гликопротеидом авидином, які мають молекулярну масу 68 кДа. Авидин утворює з біотином надзвичайно стійкий комплекс (КА = 1015моль-1). Зруйнувати такий комплекс можна тільки при температурній обробці, тому що авидин руйнується при нагріванні. Крім того, авидин має 4 місця зв'язування, до яких можна приєднати біотин або білки. Таким чином, комплекс біотин-авидин можна використовувати як сполучний місток між антитілами і ферментами. Для цього готується комплекс, що складається з ферменту, пов'язаного з біотином, і авідіна. У образующемся комплексі три центри зв'язування авідіна пов'язані через біотин з ферментом або флюорохромом, а четвертий залишається вільним (рис.3). Після інкубації з вторинними антитілами, пов'язаними з біотином, додають комплекс авидин-біотин-фермент. Таким чином, з одного молекулою антигену виявляються пов'язаними три молекули ферменту. Даний метод був названий ABC-методом (абревіатура від англійського Avidin and Biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular Complex). На жаль, і цей метод має недоліки, так як авидин з'єднується з ендогенних біотин, який у великій кількості міститься в печінці та нирках, а також він може з'єднуватися з лектинами і зарядженими групами в тканинах, так як авидин має заряд, його ізоелектіческая точка лежить в районі pH 10,0.
    Подальший розвиток отримала ця технологія після заміни авідіна на стрептавидин - білок з молекулярною масою близько 60 кДа, який отримують з мікроорганізмів Streptomyces avidinii (SaBC-метод). Стрептавідин володіє такими ж здібностями пов'язувати біотин, як і авидин, то на відміну від нього він не має заряду в нейтральному середовищі, не зв'язується з ендогенних ферментами і набагато менше з ендогенних біотин. Заміна авідіна на стрептавидин дозволила різко зменшити фонове забарвлення і підвищити чутливість методу приблизно в 8 разів.

    Таблиця 3. Системи візуалізації антигенів найбільш відомих фірм