У Києво-Могилянській академії навчалися діти духовенства, городян, козаків, селян. При ній був Сирітський будинок (Бурса). Академія ділилася на 8 (до 1680 році - на 7) класів ( «шкіл»). Після нижчих класів (фара, інфима, граматика, синтаксими) учні переходили в середні - риторики і поетики; студенти, які вирішили прийняти духовний сан, продовжували освіту в вищих класах: філософії (2 роки навчання) і богослов'я (4 роки). В академії викладалися астрономія, музика, катехізис, слов'янська і латинська словесність, слов'янський, польська, грецька, латинська, давньоєврейську, німецьку та французьку мови, історія, географія, математика, економіка, медицина, архітектура, живопис, природна історія, нотний спів і інші предмети. Спочатку викладання велося на латинській мові; з 1784 року - російською.
Всі викладачі були представниками монашествующего духовенства. В академії проводилися публічні диспути, ставилися вистави релігійного і морального змісту. Серед викладачів академії були Симеон Полоцький, Феофан Прокопович, Єпіфаній Славинецький, Стефан Яворський. Вихованцями академії були письменники, просвітителі і церковні діячі: М. Бантиш-Каменський, Г. Сковорода, гетьман України І. Самойлович.
Києво-Могилянська академія діяла до 1817 роки; в 1819 році вона була перетворена в Київську духовну академію. Її досвід використовувався при організації Слов'яно-греко-латинської академії.Національний університет «Києво-Могилянська академія» (НаУКМА) (укр. Національний університет "Києво-Могилянська Академія") на даний момент - українське вищий навчальний заклад.
Позиціонує себе як правонаступника Києво-Могилянської академії (1659-1817), зважаючи, таким чином, одним з трьох найстаріших вузів України після Острозької академії та Львівського Університету, а також однією з найстаріших вищих шкіл у Східній Європі.