1. Природні поживні середовища (застосовуються рідко).
Природні поживні середовища готують на основі сольових розчинів Хенкса і Ерла, до яких додають сироватку, амніотичну рідину, ембріональний екстракт. Ці біологічні рідини є джерелами білкового харчування, вітамінів та інших речовин, які сприяють зростанню і розмноженню клітин. Наприклад, середовище для культивування клітин HeLa: сироватка людини - 50%, курячий ембріональний екстракт - 2%, розчин Хенкса - 48%.
2. Ферментатівниє гідролізати білкових речовин.
В середовища додають ферментативні гідролізати: лактальбумина, казеїну, білків крові великої рогатої худоби.
3. Синтетичні поживні середовища, які відрізняються складним складом:
Середовищі 199 (Паркера) містить 20 амінокислот, 17 вітамінів, пуринів і піримідинів, глюкозу, 9 мінеральних солей і ряд інших речовин. Цієї середи готують на сольовому розчині Хенкса, стерилізують фільтруванням через бактеріальні фільтри.
Середа Голка містить 13 амінокислот, 4 катіона, 3 аниона, 6 вітамінів, холін, інозит і вуглеводи.
1.2.2. Типи клітинних культур
Для приготування культур клітин використовують різні тканини тварин, людини і птахів як ембріональні, так і зрілі. Крім нормальних використовують і злоякісні перерождённие тканини, отримані з пухлин.
Джерелом ембріональної тканини часто служить курячий зародок, а також ембріони людини, мишей, свиней, кролів та ін. Ембріональна і пухлинна тканини відрізняються кращою виживанням і більш активним ростом, ніж тканини дорослого організму. З зрілих тканин найчастіше вживається ниркова тканина (мавп, морських свинок, хом'яків і ін.), Амніотична оболонка людини.
Тканини беруть в асептичних умовах, промивають в сольовому розчині Хенкса і потім піддають подрібнення. У вірусології використовують тільки культури зростаючих тканин, які поділяють на:
1. Культури фіксованих шматочків тканин.
2. Одношарові культури клітин:
а) первинні культури клітин;
б) перещеплюваних (стабільні) культури клітин;
в) культури диплоїдних клітин.
3. Культури суспендованих клітин.
У практичній вірусології частіше використовують одношарові культури. клітини яких ростуть і розмножуються будучи прикріпленими до твердого субстрату (склу, пластику), утворюючи шар товщиною в одну клітку (моношар). Метод обробки одношарових культур клітин заснований на обробці вихідної тканини ферментами (зазвичай трипсином), що руйнують міжклітинні зв'язку; тканину диспергується, і утворюється суспензія ізольованих клітин. При культивуванні клітини прикріплюються до скла судини і ростуть у вигляді суцільного моношару, завдяки чому зручно впливати на клітини, заражаючи їх вірусами, і візуально спостерігати виникають зміни в динаміці.
а) Первинні культури клітин здатні розмножуватися тільки в першій генерації
Методика отримання первинних культур фібробластів курячого ембріона
1. Яйця, інкубовані 7-11 днів, овоскопіруют. Переконавшись в життєздатності ембріона, окреслюють кордон повітряного мішка.
2. Шкаралупу на тупому кінці яйця протирають спиртом, йодом, знову спиртом, а потім зрізають на рівні повітряного мішка.
3. Мають ембріон і поміщають його в стерильну чашку, видаляють голову. Тіло ембріона омивають 3-5 мл розчину Хенкса, який потім відсмоктують.
4. Тіло ембріона ретельно подрібнюють ножицями, отримані шматочки (розміром близько 1 мм 3) піпеткою переносять в пробірку.
5. Проводять 2-3-кратне відмивання подрібненої тканини від крові. Кожен раз наливають в пробірку з тканиною по 2-3 мл розчину, дають тканини осісти, після чого рідина відсмоктують.
6. До відмитої тканини додають 3 мл 0,25% розчину трипсину і ретельно перемішують вміст пробірки за допомогою «піпетування» (багаторазового насасиванія і видування рідини піпеткою) або енергійного струшування. Під дією трипсину клітини тканини роз'єднуються і утворюють суспензію, тому після осідання більших тканинних частинок на дно пробірки рідина над осадом повинна залишитися каламутній.
7. Верхній помутнілий шар рідини, що містить суспензію ізольованих клітин, переносять в центрифужную пробірку, куди заздалегідь наливається 2,5 мл живильного середовища гідролізату лактальбумина. Проводять центрифугування при 1 000 об / хв протягом 10-15 хвилин.
8. Надосадову рідина видаляють, до осаду клітин додають 2-3 мл гідролізату лактальбумина і ретельно перемішують, щоб клітини знову опинилися в підвішеному стані. Для відділення конгломератів клітин, які можуть потрапити під суспензія, рекомендується наступне фільтрування через сітку з нержавіючої сталі або марлю.
9. Проводиться підрахунок клітин в камері Горяєва під малим збільшенням мікроскопа. Визначивши концентрацію клітин у суспензії, її розводять гидролизатом лактальбумина до 400 000 клітин в 1 мл.
10. Взвесь розливають в пробірки по 1 мл, закривають гумовими пробками і поміщають в термостат при 370С в похилому положенні під кутом 50.
Через 3-4 діб від початку культивування, переглядаючи пробірки при малому збільшенні мікроскопа, можна бачити витягнуті, отростчатие клітини - фібробласти, які ростуть на стінці пробірки, образу моношар.
б) перевивали культури клітин (лінії клітин)
Перещеплюваних культури клітин мають цілу низку переваг в порівнянні первинними. Робота з ними менш трудомістка, вони відрізняються великим діапазоном чутливості до багатьох вірусів. Однак перещеплюваних культури не придатні для виробництва вірусних вакцин, так як існують побоювання з приводу їхньої можливої злоякісності.
Перещеплюваних культури клітин без пересіву на свіжу середу досить швидко дегенерують. Тому вихідну культуру клітин вирощують в матрацах з живильним середовищем, щотижня пересіваючи культуру в нові судини. При роботі з пробірочними культурами також рекомендується пересівати їх через 7-8 днів, або ж раз в 3-4 дня замінювати живильне середовище свіжої, тоді клітинні культури зберігають свою життєздатність 2-3 тижні.
Для культивування перещеплюваних культур клітин застосовують середу 199 (часто з додаванням 10% бичачої сироватки), середу Голка з додаванням 20% сироватки, 0,5% гідролізат лактальбумина, що містить 5% телячої сироватки.
в) Культури диплоїдних клітин
Їх називають полуперевіваемие культурами, так як іні мають здатність до пересіву протягом тривалого часу - витримують до 40-50 пасажів, які проводилися протягом 8-10 місяців. Потім культура клітин дегенерує і гине. Диплоїдними їх називають, тому що вони стійко зберігають диплоїдний каріотип, властивий вихідним нормальним клітинам організму - родоначальниці диплоидной лінії.
Культури диплоїдних клітин отримують з різних тканин ембріона людини, з первинних культур. Так, наприклад, користується популярністю штам ДКЛЧ (диплоїдні клітини легенів людини), штами WJT-38, JMR-90, MRC-5 з легких тканини ембріона людини.
Диплоїдні культури застосовують для виділення і культивування вірусів. Вони чутливі до багатьох штамів вірусів, онкогенні безпечні, придатні для культивування в промислових масштабах і отримання масового кількості вірусних вакцин.
Мал. 2. Культури клітин
Культури суспендованих клітин
Суспендованих культура - це культура, в якій окремі клітини або їх конгломерати постійно знаходяться в підвішеному стані в рідкому середовищі.
Культури клітин в суспензії вдається отримати, якщо проводити їх культивування при постійному інтенсивному перемішуванні середовища шляхом обертання пробірок в барабані, за допомогою магнітної мішалки і т. П. Останнім часом використовують спеціальні апарати - Хемостат, в яких забезпечується автоматичне оновлення середовища. Суспендовані клітини мають більшу активність зростання, накопичуються у великій кількості, при регулярній заміні середовища тривалий час залишаються життєздатними.
1.3. Культивування вірусів в курячих ембріонах
Багато віруси, що вражають людину і тварин, можуть більшою чи меншою мірою розмножуватися в курячому ембріоні. Наявність щільною шкаралупи захищає ембріон від попадання мікроорганізмів із зовнішнього середовища.
Метод культивування вірусів в курячих ембріонах використовують при лабораторній діагностиці вірусних інфекцій, а також для виготовлення вірусних вакцин і діагностичних препаратів. Але цей метод має недоліки: 1) неможливо спостерігати в динаміці за патологічними змінами, що відбуваються в ембріоні після зараження його вірусом; 2) при розтині ембріона, зараженого вірусом, часто не виявляється видимих змін і доводиться виявляти наявність вірусу в тканинах, в рідинах ембріона, користуючись іншими вірусологічними методами (наприклад, реакцією гемаглютинації); 3) метод культивування в курячих ембріонах придатний не для всіх вірусів. Незважаючи на наявні недоліки метод порівняно простий, зручний і дешевий і широко використовується в вірусологічних дослідженнях. Найбільше значення він має при роботі з ортоміксовірусів, герпесвирусами, поксвирусов.
1.3.1. Будова курячого ембріона
Курячий ембріон покритий вапняної оболонкою - шкаралупою, до якої зсередини примикає шкаралуп'яну оболонка. У тупому кінці яйця вона роздвоюється і укладає в собі повітряний простір. Під шкаралуп'яну оболонкою знаходиться хоріоналлантоісной оболонка, в тупому кінці яйця вона проходить по внутрішній стороні шкаралуп'яну оболонки, що замикає повітряний простір, ця оболонка багата кровоносними судинами і служить ембріону органом дихання. Зсередини до неї прилягає аллантоісная порожнину, яка є органом виділення і захищає зародок від висихання і травм. Аллантоісная порожнину оточує зародок, що знаходиться в порожнині амніону, яка наповнена навколоплідної рідиною. Через жовтковий канатик зародок з'єднаний з жовтковим мішком - основним джерелом поживних речовин.
Для успішного культивування вірусів в організмі курячих ембріонів потрібний певний температурний режим (360-380), вологість (50-70%), а також достатня вентиляція. Заражають курячі ембріони певного віку, інкубовані від 6 до 13 днів в залежності від виду вірусів і методу зараження. Необхідно підготувати: підставку для яйця, бульбашки зі спиртом і йодом, пробірку із стерильним парафіном, покривні скла, пакетики стерильної вати і марлі, загорнуту в папір стерильний посуд, стерильні шприци, голки, пінцети, препарувальні голки. Інструменти поміщають в стаканчик зі спиртом, де вони знаходяться протягом всієї роботи, перед кожною маніпуляцією їх додатково стерилізують обпаленням в полум'я пальника. Руки перед роботою ретельно миють, рекомендується надіти маску з марлі.
Для роботи відбирають життєздатні ембріони, просвічуючи інкубовані яйця в овоскопі. Життєздатний ембріон рухливий, кровоносні судини оболонки заповнені кров'ю. Відібрані яйця ретельно дезінфікують на тупому кінці (або на бічній стороні яйця): шкаралупу протирають спиртом, змащують йодом, повторно обробляють спиртом і обпалюють.
1.3.2. Зараження курячого ембріона на хоріоналлантоісной оболонку
Для зараження використовують курячі ембріони 10-12-денного віку. Основні етапи зараження:
1. Яйце поміщають на підставку в вертикальному положенні так, щоб повітряний мішок перебував нагорі, проводять стерилізацію шкаралупи на тупому кінці яйця.
2. Над центром повітряного мішка роблять прокол шкаралупи за допомогою препаровальной голки.
3. в отвір вводять браншу ножиць і вирізують вікно в шкаралупі близько 1,5 см в діаметрі.
4. Через отвір обережно надривають голкою внутрішній листок шкаралуп'яну оболонки і отслаивают на невеликій ділянці (0,5-1 см2).
5. Проводять зараження хоріоналлантоісной оболонки шляхом нанесення на неї 0,1-0,2 мл віруссодержащего матеріалу за допомогою пастерівської піпетки або шприца.
6. Віконце в шкаралупі закривають спеціальною еластичною плівкою або стерильним покривним склом і прикріплюють розплавленим парафіном.
Заражені ембріони поміщають в термостат в вертикальному положенні і інкубують протягом 2-3 діб, після чого роблять розтин за такими правилами:
1. Яйце поміщають на підставку так, щоб повітряний простір було нагорі, проводиться стерилізація місця розтину.
2. Стерильними ножицями зрізають шкаралупу по межі повітряного простору.
3. Користуючись пінцетом, знімають шкаралуп'яну оболонку по межі. Оголену хоріоналлантоісной оболонку підрізають уздовж краю шкаралупи. Через отвір, що утворився виливають весь вміст яйця в чашку або лоток.
4. Частину, що залишилася всередині шкаралупи хоріоналлантоісной оболонку обережно витягують пінцетом і поміщають в стерильну чашку з фізіологічним розчином. Тут її розправляють і вивчають зміни, помістивши чашку на темний фон.
З через великий обсяг цей матеріал розміщений на декількох сторінках:
1 2 3