Для виявлення пироплазмидо досліджують мазки крові від тварин, хворих або підозрюваних у захворюванні. У разі загибелі або вимушеного забою хворих тварин мазки можна готувати з вмісту судин мозку, селезінки, печінки, нирок, легенів і уражених лімфатичних вузлів.
Мазки готують тільки з органів свіжих трупів, так як в них паразити швидко лізуються, особливо при високій температурі навколишнього середовища. В необхідних випадках вживають заходів для виключення інфекційних хвороб.
Використовують добре знежирені скла. Кров для дослідження найкраще брати з периферичних судин вушної раковини. Місце взяття готують шляхом вистригання волосяного покриву, потім проводять дезінфекцію і знежирення етиловим спиртом, спиртом-ефіром. Ін'єкцію проводять голкою або підрізають ножицями кінчик вуха.
Краплю крові в діаметрі не більше 2-3 мм, яка виступає на місці проколу, наносять на край знежиреного предметного скла і роблять мазок. Дуже важливо мазок підготувати з першої краплі крові, тому що в ній значно більше уражених пироплазмидо еритроцитів. Наступний мазок необхідно готувати зі свіжої краплі крові після видалення згустку з місця ін'єкції.
Виготовлення мазків необхідно проводити в період підвищення температури тіла тварин і появи перших клінічних ознак, до введення специфічних препаратів. Мазки просушують на повітрі 10-20 хв, уникаючи дії прямих сонячних променів і обмежуючи доступ мух. Потім їх підписують голкою або простим олівцем, вказуючи вид та номер тварини, дату і місце взяття.
Для фіксації використовують метиловий спирт, яким заливають мазки крові на 3-5 хв, після цього скла виймають і висушують 15-20 хв.
Можна фіксувати сумішшю рівних частин абсолютного етилового спирту і ефіру або тільки етиловим спиртом 15-20 хв.
Добре підготовлений мазок повинен бути рівномірним і тонким. У товстих мазках еритроцити і знаходяться в них паразити виявляються з великими труднощами.
Забарвлення можна виробляти за Романовським-Гімзою. Для приготування робочого розчину фарби на 1 мл дистильованої води додають 1-3 краплі основного розчину фарби. Робочий розчин найкраще подслаівать під скло з мазком. У цих випадках на мазку не залишається мікрочастинок не розчиняється фарби, що полегшує при мікроскопії пошук кільцеподібних форм пироплазмидо і диференціальну діагностику. Тривалість фарбування мазків складає 30-40 хв. Після закінчення цього терміну фарбу змивають, мазок промивають дистильованою водою, висушують і досліджують з використанням мікроскопа. Якість фарбування залежить від рН середовища (оптимальним середовищем є 6,8-7,0). Правильно забарвлені мазки мають рожевий колір з фіолетовим відтінком. Еритроцити фарбуються в рожевий колір, протоплазма лімфоцитів - в синій, їх ядра - в темно-фіолетовий, протоплазма паразитів - в блакитний, шматочки хроматину - в темно-червоний або червоний колір.
Досліджують мазки під мікроскопом з иммерсионной системою.
Діагностика еймеріозов і ізоспороз
Для виявлення наявності ооцист еймерій і ізоспор з фекалій, вмісту кишечника та іншого матеріалу використовується кілька методів.
Метод нативного мазка найбільш простий і легко здійсненний в будь-яких умовах, що не вимагає спеціальної апаратури і реактивів для виявлення ооцист.
На чисте предметне скло піпеткою наносять 2-4 краплі чистої води (дистильованої, водопровідної), до них додають невелику кількість фекалій і перемішують. Мазок накривають покривним склом і досліджують під малим (х 8,10) і середнім (х 40) об'єктивом. Замість фекалій можна досліджувати таким же чином зіскрібки оболонок кишечника.
При невеликому ступені зараження ооцист виявити таким методом важко, проте при високому зараженні він дає можливість порівняно достовірно визначити інтенсивність інвазії.
Більш точні результати одержують при використанні різних розчинів, що мають велику питому вагу. У таких розчинах ооцисти через деякий час спливають на поверхню.
Найбільш поширеними флотаційні методи є наступні: методи Фюллеборна, Дарлінга, Щербовічу, Котельникова і Хренова і ін. (Див. Гельмінтоовоскопії).
Дослідження еймеріід в уражених органах. Для дослідження на наявність еймеріід у тварин відбирають шматочки тонкого і товстого кишечника, у кроликів, крім того, печінку, у гусей також нирки. Матеріал поміщають в фіксуючу рідину - 10% -ний розчин формаліну або 96% -ний етиловий спирт. Найкраще використовувати нейтральний формалін, для приготування якого використовують порошок вуглекислого кальцію (крейда), 10% його додають до обсягу формаліну і дають відстоятися 5-6 днів, потім зберігають з осадом.
Фіксацію матеріалу краще проводити в скляному посуді. У зимовий час в якості фіксує рідини краще використовувати етиловий спирт. Її, незалежно від пори року, рекомендується через добу замінювати. Якщо в одну банку поміщають шматочки органів від різних тварин, їх рекомендується звернути в марлеві мішечки. Всередину банки з фіксуючим матеріалом розташовують паперову етикетку, на якій графітним олівцем вказують вид тваринного, його номер і дату взяття матеріалу.
Приготовлені гістологічні зрізи найкраще фарбувати гематоксилін-еозином.
При необхідності збереження ооцист еймеріід на тривалий час використовують 5% -ний розчин формаліну, 0,1% -ний розчин калію біхромату, рідина Барбагалло (3% -ний розчин формаліну на фізіологічному розчині натрію хлориду).
Для виділення токсоплазм використовують органи полеглих тварин: головний мозок, лімфатичні вузли, печінку, селезінку, легені, плаценту і органи абортовану плода. Спочатку готують мазки-відбитки з уражених органів, які фіксують метиловим спиртом (етиловим) і забарвлюють за Романовським-Гімзою. Відбір органів і приготування мазків проводять не пізніше 2-3 годин після забою або падежу тварин.
Зазначеним способом виділити токсоплазм вдається не завжди.
Більш ефективним способом є постановка біопроб на білих мишах.
Для цього відібраний матеріал з внутрішніх органів розтирають з невеликою кількістю ізотонічного розчину натрію хлориду і отриману суспензію вводять 3-5 білим мишам внутрішньоочеревинно по 0,5 мл. В позитивних випадках на 5-7 день розвивається хвороба, при якій в черевній порожнині накопичується ексудат, який містить велику кількість токсоплазм. При негативній біопробі, а також для накопичення токсоплазм можна проводити 3-5 «сліпих пасажів» шляхом введення суспензії головного мозку мишей від заражених раніше білих мишей нової партії мишам.
Методичними вказівками з лабораторних досліджень на токсоплазмоз тварин, затвердженими 21.01.84, рекомендується для збагачення матеріалу цистами застосовувати метод штучного перетравлення в шлунковому соку. Патматеріал (лімфовузли, довгастий мозок абортовану плода) подрібнюють, 50 г фаршу поміщають в колбу ємністю 1 літр і заливають 10 обсягами штучного шлункового соку. Колбу поміщають в термостат при температурі 37 ° С на 1,5 години. Отриману масу фільтрують через марлю, потім фільтрат центрифугируют при 2 тис. Об. / Хв. протягом 15 хвилин. Після видалення надосадової рідини осад ресуспензіруют в подвійному обсязі ізотонічного розчину з додаванням антибіотиків (пеніцилін, стрептоміцин по 1 тис. ОД на 1 л суспензії). Суспензію в дозі 0,3 мл вводять внутрішньочеревно 3-5 білим мишам.
Для виявлення токсоплазм готують мазки з вмісту черевної порожнини або мазки-відбитки з головного мозку, фіксують, потім фарбують за Романовським-Гімзою.
Наявність збудника в організмі тварин може бути підтверджено шляхом використання РСК (РДСК), яку ставлять відповідно до «Тимчасового настановою щодо застосування токсоплазмозного антигену Каз.НІВІ і інституту зоології АН Каз.ССР в реакції зв'язування комплементу РСК (РДСК) для серологічної діагностики токсоплазмозу і токсоплазмоносітельства у тварин ».
Для виявлення саркоцист досліджують у овець шийну частину стравоходу, скелетні м'язи. Знаходять макроцисти завбільшки з просяне зерно і більше.
У свиней їх можна виявити в м'язах діафрагми, міжреберних і ін. Саркоцистами звільняють від навколишньої тканини, на предметному склі руйнують в 2-3 краплях ізотонічного розчину натрію хлориду, потім краплю суспензії микроскопируют при середньому збільшенні мікроскопа з опущеним конденсором. В позитивних випадках виявляють банановідние (серповидні) мерозоїти.
Виявлення мікроцисти виробляють шляхом дослідження зрізів завбільшки з вівсяне зерно з м'язів стравоходу, діафрагми, серця, скелета. Зрізи досліджують в роздавленому в компресор вигляді під малим збільшенням мікроскопа. Їх можна фарбувати за Романовським-Гімзою, генціанвіолетом, метиленової синню і ін.
Саркоцист можна також виявити і при гістологічному дослідженні уражених тканин. Відібрані шматочки тканини фіксують в 10% розчині нейтрального формаліну. Гістосрези готують загальноприйнятими методами, а фарбують гематоксилін-еозином.
Виділення трихомонад виробляють шляхом мікроскопічного і культурального дослідження патологічного матеріалу (закінчення і змиви з статевих органів, навколоплідної рідини, зіскрібки з плаценти, вміст сичуга абортовану плода, секрет придаткових статевих залоз, сперми).
Для виявлення рухомих трихомонад наносять на предметне скло патологічний матеріал у вигляді товстого мазка або роблять розчавлену краплю і проводять мікроскопію спочатку під малим, потім середнім збільшенням мікроскопа при затіненому поле зору мікроскопа. Мазок можна фарбувати за Романовським-Гімзою з попередньою фіксацією в метиловий спирт.
Посіви досліджуваного матеріалу виробляють на спеціальні живильні середовища (середа Петровського) в кількості 0,3-0,5 мл з осаду проби. Матеріал поміщають в термостат при 370С і досліджують на 3, 5, 7 і 10 день. Уже через 24-46 годин може спостерігатися зростання трихомонад.
Вищевказані методи використовуються для виділення трихомонад при ураженні статевих органів у великої рогатої худоби.
У свиней, птахів трихомонади живуть в кишечнику і деяких інших органах. Для виділення паразитів використовують зіскрібки з уражених органів і досліджують нативним мазком.
Є дані про те, що і ці трихомонади добре ростуть на штучних поживних середовищах.
Виділення балантидій виробляють шляхом дослідження свежевиделенних фекалій або взятих з прямої кишки тварини. Матеріал необхідно піддати дослідженню не пізніше 2-3 годин після його взяття. Трупи свиней на наявність балантидій досліджують протягом 5-6 годин після смерті тварини. У більш пізні терміни балантидій виявити не вдається у зв'язку з їх лізисом. За деякими даними (А. І. Федоров, 1980) трупи слід піддавати дослідженню на виявлення балантидій протягом 1,5-2 годин після забою або загибелі поросят.
Мікроскопічне дослідження фекалій найкраще провести безпосередньо на фермі, використовуючи метод нативного мазка. Для цього беруть невелику кількість фекалій, поміщають на предметне скло і рівномірно перемішують з рівною кількістю теплого ізотонічного розчину натрію хлориду або дистильованої води (температура не більше 37,0 ° С), накривають покривним склом і переглядають мазок під малим збільшенням мікроскопа. В позитивних випадках виявляють вегетативні форми і цисти балантидій. Під мікроскопом чітко видно великі, швидко пересуваються за допомогою війок паразити.
При необхідності гістологічного дослідження відбирають шматочки стінок товстого і тонкого кишечника, шлунка, лімфовузлів, паренхіматозних органів і фіксують в 10% розчині формаліну. Гістосрези фарбують гематоксилін-еозином.