Білки в розчині і відповідно в організмі зберігаються в нативному (природному) стані за рахунок факторів стійкості, до яких відносяться заряд білкової молекули і гідратне (водна) оболонка навколо неї. Видалення цих факторів призводить до склеювання молекул і випадання їх в осад. Осадження білків може бути оборотним і необоротним в залежності від складу реактивів і умов реакцій. В клінічній лабораторній практиці реакції осадження використовують для виділення альбумінової і глобулиновой фракцій (груп) білків плазми крові, кількісної характеристики їх стійкості в плазмі, виявлення білків у біологічних рідинах і звільнення від них з метою отримання безбілкового розчину.
Під дією факторів осадження білки випадають в осад, але після припинення дії (видалення) цих факторів білки знову переходять в розчинний стан і набувають свої нативні властивості. Одним з видів оборотного осадження білків є висолювання.
Принцип: насиченим розчином сульфату амонію осідає альбумінової фракція білків, напівнасичення розчином сульфату амонію - глобулінового фракція.
Суть реакції полягає в дегідратації (зневодненні) молекул білка.
Реактиви: 1) нерозбавлений яєчний білок; 2) насичений розчин сульфату амонію; 3) гідроокис натрію, 10% розчин; 4) сульфат міді, 1% розчин; 5) сульфат амонію в порошку; 6) дистильована вода.
Хід визначення: в пробірку наливають 30 крапель нерозведеного яєчного білка і додають рівну кількість насиченого розчину сульфату амонію. Вміст пробірки перемішують. Отримують напівнасичення розчин сульфату амонію, при цьому глобулінового фракція білка осідає, а білковий залишається в розчині. Через 5 хвилин осад відфільтровують, на фільтрі залишається глобулінового фракція, а в фільтраті - білковий. Осад з фільтрату знімають скляною паличкою і переносять в пробірку, куди додають кілька крапель води, поки не розчиниться осад. Наявність в розчині білка можна довести за допомогою биуретовой реакції, яка буде позитивною.
У пробірку з фільтратом додають порошок сульфату амонію до повного насичення розчину, тобто до тих пір, поки не припиниться розчинення солі. При цьому випадає осад - альбуміни. Його фільтрують, осад з фільтру знімають скляною паличкою, розчиняють водою і проводять біуретову реакцію.
Необоротне осадження білків пов'язано з глибокими порушеннями структури білків (вторинної та третинної) і втратою ними своїх нативних властивостей, тобто денатурацією. Такі зміни білків можна викликати шляхом кип'ятіння, дією концентрованих розчинів мінеральних і органічних кислот, солями важких металів і т.д.
Реакція №2 «Осадження при кип'ятінні»
Принцип: білки є термолабільними сполуками і при нагріванні понад 50-60 0 С денатуруються. Сутність теплової денатурації полягає в руйнуванні гідратної оболонки, розрив стабілізуючих білкову молекулу зв'язків і розгортанні білкової молекули. Найбільш повне і швидке осадження відбувається в ізоелектричної точці (коли заряд молекули дорівнює нулю), оскільки при цьому частки білка найменш стійкі. Білки, що володіють кислими властивостями, осідають в слабокислою середовищі, а білки з основними властивостями - в слабощелочной. У сильнокислому або сільнощелочних розчинах денатурований при нагріванні білок в осад не випадають, тому що його частки перезаряджаються і несуть в першому випадку позитивний, а в другому - негативний заряд, що підвищує їх стійкість в розчині.
Реактиви: 1) яєчний білок, 1% розчин; 2) оцтова кислота, 1% і 10% розчини; 3) гідроокис натрію, 10% розчин.
Хід визначення: в 4 пронумеровані пробірки доливають по 10 крапель розчину яєчного білка. Потім 1-ю пробірку нагрівають до кипіння, при цьому розчин білка мутніє, але так як частинки денатурованого білка несуть заряд, вони в осад не випадають. Це пов'язано з тим, що яєчний білок має кислі властивості (ізоелектрична точка його рН 4,8) і в нейтральному середовищі заряджений негативно. У 2-у пробірку додають 1 краплю 1% розчину оцтової кислоти і нагрівають до кипіння. Білок випадає в осад, так як його розчин наближається до ізоелектричної точці і білок втрачає заряд (один з факторів стійкості білка в розчині). В 3-ю пробірку додають 1 краплю 10% оцтової кислоти і нагрівають до кипіння. Осаду не утворюється, так як в сильнокислой середовищі частинки білка набувають позитивний заряд (зберігається один з факторів стійкості білка в розчині). В 4-ю пробірку додають 1 краплю розчину гідроксиду натрію і нагрівають до кипіння. Осад не утворюється, оскільки в лужному середовищі негативний заряд частинок білка збільшується.
Реакція №3 «Осадження солями важких металів»
Принцип: білки при взаємодії з солями свинцю, міді, ртуті, срібла і інших важких металів денатуруються і випадають в осад. Однак при надлишку деяких солей спостерігається розчинення спочатку утвореного осаду. Це пов'язано з накопиченням іонів металу на поверхні денатурованого білка і появою позитивного заряду на білковій молекулі.
Реактиви: 1) яєчний білок, 1% розчин; 2) сульфат міді, 10% розчин; 3) ацетат свинцю, 5% розчин, 4) нітрат срібла, 5% розчин.
Хід визначення: в 3 пронумеровані пробірки вносять по 5 крапель розчину яєчного білка. У 1-у пробірку додають 1 краплю сульфату міді. У 2-у пробірку додають 1 краплю ацетату свинцю. В 3-ю пробірку додають 1 краплю нітрату срібла. У всіх пробірках випадає осад. Потім в першу пробірку додають 10 крапель сульфату міді і в другу пробірку додають 10 крапель ацетату свинцю і спостерігають розчинення осаду. У третю пробірку вносять 10 крапель нітрату срібла - розчинення осаду немає.
Реакція №4 «Осадження концентрованими мінеральними кислотами»
Принцип: концентровані кислоти (сірчана, соляна, азотна та ін.) Викликають денатурацію білка за рахунок видалення факторів стійкості білка в розчині (заряду і гідратної оболонки). Однак при надлишку хлористоводневої та сірчаної кислот осад, що випав денатурованого білка знову розчиняється. Мабуть, це відбувається в результаті перезарядки молекул білка і часткового гідролізу. При додаванні надлишку азотної кислоти розчинення осаду не відбувається (точний механізм цього явища не встановлено). Ось чому для визначення малих кількостей білка в сечі в клінічних лабораторіях користуються азотною кислотою.
Реактиви: 1) яєчний білок, 1% розчин; 2) концентрована сірчана кислота; 3) концентрована соляна кислота; 4) концентрована азотна кислота.
Хід визначення: в 3 пронумеровані пробірки наливають по 10 крапель концентрованих кислот: в 1-у пробірку сірчану кислоту, в 2-у пробірку хлористоводородную, в 3-ю пробірку азотну. Потім, нахиливши пробірку під кутом 45 0 С, обережно по стінці пробірки (так, щоб рідини не змішувалися) нашаровуються 1 краплю розчину яєчного білка. На кордоні двох шарів з'являється осад білка у вигляді білого кільця. Обережно струшують пробірки, і додають надлишок кислот, після чого спостерігають розчинення білка в пробірках з сірчаної і соляної кислотами, а в пробірці з азотною кислотою розчинення білка не відбувається.
Реакція №5 «Осадження органічними кислотами»
Принцип: трихлороцтової кислота осаджує тільки білки, а сульфосаліцилова осаджує не тільки білки, а й високомолекулярні поліпептиди. Сульфосаліціловой кислотою (як найбільш чутливою) широко користуються для виявлення білка в сечі.
Реактиви: 1) яєчний білок, 1% розчин; 2) трихлороцтової кислота, 10% розчин; 3) сульфосаліцилова кислота, 20% розчин.
Хід визначення: в 2 пронумеровані пробірки доливають по 5 крапель розчину яєчного білка. Потім в 1-у пробірку додають 2 краплі сульфосалициловой кислоти, а в 2-у пробірку додають 2 краплі трихлороцтової кислоти. У пробірках випадає осад білка.