Винахід відноситься до біотехнології. Для отримання пробіотика Біфіціна використовують біомасу штамів Bifidobacterium longum В-12, Lactobacillus plantarum P-19, Enterococcus faecium E-18, Bacillus subtilus B-26, виділених від здорових телят раннього віку та ефективних як профілактичний і лікувальний препарат при діарейних захворюваннях телят. Пробіотик володіє широким антимікробним спектром дії проти умовно-патогенних і патогенних мікрооорганізмов, синтезує біологічно активні речовини, підвищує неспецифічну резистентність організму телят.
Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості, виробництва пробіотиків, біотехнології і призначене для отримання препаратів з живих мікроорганізмів, що володіють високою антагоністичною активністю проти умовно-патогенних і патогенних мікроорганізмів, які синтезують біологічно активні речовини, конкурентноспроможних і виявляють виражений профілактичний і лікувальний ефект при порушеннях травлення у телят раннього віку.
Одним із засобів для отримання препаратів є використання чистих культур біфідобактерій, лактобактерій та Bacilus subtilis, адаптованих до складу живильного середовища на молочній основі та умов виробництва.
Культури біфідо-і лактобактерій, В. subtilis для препаратів повинні мати більшу біологічну активність в порівнянні з відомими.
В даний час для отримання препаратів ветеринарного призначення застосовують бифидумбактерин (В. bifidum), Ветом-1.1. (В. Subtilis), лактоаміловарін (Lactobacillus amilovorus) [1, 2, 3].
Але ці препарати включають штами одного виду бактерій і не мають високу біологічну активність.
Метою винаходу є отримання комплексу активних штамів, які мають широкий спектр антимікробної дії до загальних патогенних мікроорганізмів, синтезом біологічних речовин, здатністю адаптуватися до умов травного тракту і антибіотиків, інтенсивністю розмноження в виробничих умовах.
Поставлена мета досягається використанням штамів Bifidobacterium longum B-12, Lactobacillus plantarum P-19, Enterococcus faecium Е-18, Bacillus subtilus B-26, виділених з кишкового каналу здорових телят раннього віку (5-20 днів) і володіють широким антимікробним спектром дії проти умовно-патогенних і патогенних мікроорганізмів, які синтезують біологічно активні речовини, стійкі до антибіотиків і умов середовища травного тракту. Штами непатогенних, токсичних та токсигенних властивостей не виявляють, знаходяться в колекції музею чистих культур мікроорганізмів ВГМХА ім. Н. В. Верещагіна. Штами використовують для отримання пробіотика біфіціна в рідкій і сухій формі.
Застосовують препарат телятам, починаючи з першого дня життя разом з молозивом. У травному тракті телят штами стимулюють розмноження корисної мікрофлори і її ферментативну активність, забезпечують підтримку оптимального мікробного балансу в кишечнику телят.
При згодовуванні телятам раннього віку штами підвищують неспецифічну резистентність, ймовірність захворювання і загибелі, мають значний лікувально-профілактичним ефектом при розладах травлення, клінічно проявляються діареєю.
Штами характеризуються такими ознаками.
Штам Bifidobacterium longum В-12.
Клітини штаму представлені середньої довжини з розгалуженням або кавалками кінцями паличками. Нерухомі, спор не утворюють. Однодобового культури по Граму фарбуються позитивно.
Колонії на печінковому агарі поверхневі, розміром 2-3 мм у вигляді чечевичек, внутрішня структура однорідна. Глибинні колонії у вигляді цвяхів.
У рідких печінкової і гідролізатную-молочної середовищах утворюють зважені в нижній частині пробірки і фіксовані на стінках пробірки дрібні пластівці, що випадають в світло-коричневий осад.
Анаероб. Оптимальна температура розвитку (37 1) o C, мінімальна (20 1) o С, максимальна (49 1) o С. Добре росте при рН 6,0-7,5. Газа з глюкози не утворює. Каталазоотріцателен. Нітрати НЕ редукує. Не утворює індол, сірководень, аміак. Молоко згортає. Зростає в середовищах з 2% хлористого натрію, 20% жовчі. Володіє протеолітичної активністю. Ферментує арабинозу, рибозу, ксилозу, лактозу, мелецітозу, крохмаль, трегалозу. Чи не засвоює глюконат, целлобіоза, маніт, салицин. Зброжує лактозу з утворенням оцтової та молочної кислот. Виявляє антимікробний спектр дії до бактерій родів Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella.
Штам проявляє стійкість до тетрацикліну, стерептоміціну, канаміцину, неоміцину.
Штам непатогенних, токсичних та токсигенних властивостей не проявляє.
Штам Lactobacillus plantarum P-19.
Клітини штаму мають форму паличок, середньої довжини, поєднання в мазках одиночне, попарно. Нерухомі, спор не утворюють. За Грамом забарвлюються позитивно.
Колонії на МРС і гідролізатную-молочному агарі (30 o С, 48 ч) великі, гладкі, світлі, профіль піднятий.
У рідких середовищах утворюється помірна муть, осад щільний, легко взмучивают при струшуванні.
На глюкозний МПБ помутніння, дрібні пластівці, пристінковий зростання і щільний осад.
Факультативний анаероб. Оптимальна температура розвитку (30 1) o С, мінімальна (10 1) o С, максимальна (38 1) o С. Добре росте в межах рН 5,2-7,4. Газа з глюкози не утворює. Каталазоотріцателен. Нітрати НЕ редукує. Зростає в середовищах з 2, 4 і 6% хлористого натрію, 20% жовчі, 0,4% фенолу. Молоко згортає. Володіє протеолітичної активністю.
Кислоту продукує з Арабіноза, галактози, лактози, мальтози, манози, рафінозі, рибози, сахарози, фруктози, маннита, салицина, сорбіту, целлобіози, мелецітози. Чи не ферментує крохмаль, ксилозу, рамнозу.
Лактозу ферментує з утворенням молочної і оцтової кислот. Має антимікробну спектром дії до бактерій родів Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Candida.
Штам проявляє стійкість до хлорамфеніколу, тетрацикліну, cтерептоміціну, поліміксину.
Штам непатогенних, токсичних та токсигенних властивостей не проявляє.
Штам Enterococcus faecium E-18.
Клітини штаму мають форму елліпсовідних коків в поєднаннях парами і ланцюжками. Нерухомі, спор не утворюють, грампозитивні.
Колонії на молочно-інгібіторної середовищі чорного кольору, гладкі, опуклі, дрібні. На середовищах з полимиксином колонії блакитні, на МПА з вуглеводами прозорі, круглі, дрібні.
У МПБ з глюкозою плівки не утворюють, муть помірна, осад щільний, рясний.
Факультативний анаероб. Оптимальна температура росту (37 1) o С, мінімальна (10 1) o С, максимальна (75 2) o С. Добре росте при рН 7,4-10,5. Зростає в середовищах з 6% натрію хлориду, 40% жовчі, 0,4% фенолу, 0,1% метиленового блакитного. Молоко згортає. Каталазоотріцателен. Нітрати НЕ редукує. Газа з глюкози не утворює.
Ферментує арабинозу, галактозу, ксилозу, лактозу, мальтозу, маянозу, раффинозу, сахарозу, фруктозу, салицин, екскулін, целлобіоза з утворенням кислоти. Рамнозу, рибозу, крохмаль, маніт, мелецітозу не ферментує.
Штам проявляє антимікробний спектр дії до бактерій родів Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella.
Володіє стійкістю до неоміцину, тетрацикліну, стерептоміціну, бензилпенициллину.
Штам непатогенних, токсичних та токсигенних властивостей не проявляє.
Штам Bacillus subtilus B-26.
Клітини штаму палочковидной форми середньої довжини, кінці клітин зрізані, капсули відсутні, рухливі. Фарбуються за Грамом позитивно. Мають центральне розташування суперечка в клітці, форма суперечка еліпсовою.
Колонії на МПА (37 o С, 24 ч) неправильної форми, великі з порізаним краєм, з шорсткою поверхнею, плоским профілем, світло-сірого кольору.
На МПБ утворює плівку, помутніння середовища не викликає, осаду через 24 год не дає.
Аероб. Оптимальна температура розвитку (37 1) o С, мінімальна (18 2) o С, максимальна (48 2) o С. Зростає в поживних середовищах із значенням рН 6,0-8,5. Каталазоположітелен. Нітрати редукує. Молоко не згортає. Володіє протеолітичної, амілазной, желатіназной активністю. Утворює кислоту з глюкози, Арабіноза, ксилози, маніту.
Штам має антимікробну спектром дії до бактерій родів Staphylococcus, Proteus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella.
Штам не чутливий до неоміцину, тетрацикліну, рифампіцину, ампіциліну.
Штам непатогенних, токсичних та токсигенних властивостей не проявляє.
Приклад 1. Живильне середовище, що містить: молоко, гідролізований панкреатином - 10,0%, глюкозу - 5,0%, дріжджовий екстракт (рН 6,5) 1,0% піддають стерилізації, охолоджують до (37 1) o С, інокуліруют добовими культурами штамів: B. longum B-12, L.plantarum P-19, E.facium E-18, B.subtilis B-26 в дозі 5-10% до обсягу середовища. Посіви інкубують при (37 1,0 o С) протягом 14-18 год і отримують титр життєздатних клітин (1-1,2 млрд / мл).
Рідкий препарат фасують в скляні флакони об'ємом 200 мл, герметично закупорюють і випускають для використання.
Приклад 2. Сухий препарат отримують при відділенні клітин мікроорганізмів від живильного середовища центрифугуванням при 3000 х g протягом 15 хв. Потім отриману біомасу змішують з одним з адсорбентів - глюкозою, сухим знежиреним молоком, крохмалем - в співвідношенні 1:10.
Штами мікроорганізмів забезпечують профілактичну і лікувальну дію при диспептичних захворюваннях.
Джерела інформації
1. А.с. 343588.
2. Патенти РФ 97113452, 97113006, 97112246.
3. Патент РФ 2054478.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
Пробіотик для телят, що містить біомасу штамів Bifidobacterium longum В-12, Lactobacillus plantarum P-19, Enterococcus faecium E-18, Bacillus subtilus B-26 в колекції музею чистих культур мікроорганізмів Вологодської державної молочнохозяйственной академії ім. Н. В. Верещагіна.