Робота 1. Виділення запасних білків і вивчення їх властивостей
Матеріали та обладнання. 1) горохова борошно. % - ний розчин (NH 4) 2 SO 4.
3) (NaCl) (суха сіль), 4) концентрована HNO 3 в крапельниці з притертою піпеткою (зберігати у витяжній шафі), 5) концентрований розчин NH 3 в крапельниці, 6) 10% - ний розчин NaOH. 7) 1% - ний розчин CuSO 4. в крапельниці, 8) 5% - ний розчин оцтовокислого свинцю в крапельниці, 9) технічні ваги з важками, 10) колби конічні на 100 - 150 мл (3 шт.), 11) воронка , 12) штатив із пробірками (7 шт), 13) мірні циліндри, 14) калька, 15) фільтр паперовий, 16) спиртівка, 17) держалкі для пробірок, 18) сірники.
Білки - найважливіші компоненти всіх живих клітин. Макромолекули білка мають молекулярну масу від 10000 до декількох мільйонів і складаються з однієї або декількох поліпептидних ланцюгів, побудованих з юольшогог кількості амінокислотних залишків.
За розчинності білки діляться на чотири групи. 1) альбуміни (розчинні у воді), 2) глобуліни (в слабких розчинах нейтральних солей), 3) проламіни (в 60 - 80% - ном етиловому спирті), 4) глютеліни (в слабких розчинах лугів).
Білки - гідрофільні речовини: кожна молекула білка утримує до 18 тис. Молекул води. Дегідратація білків (втрата ними гідратних оболонок) призводить до їх коагуляції (випадання в осад).
Дуже багаті білками насіння бобових. Основні запасні білки цих насіння - глобуліни.
Хід роботи. Відважити на шматку кальки 5 г горохової муки, перенести в колбу і залити 30 мл 10% - ного розчину (NH 4) 2 SO 4. Збовтувати протягом 3 хв і дати відстоятися. Через 30 хв профільтрувати через складчастий паперовий фільтр, змочений тим же розчином (NH 4) 2 SO 4. Перші каламутні порції фільтрату злити назад на фільтр. Отриманий прозорий розчин глобуліну розлити по 2 - 3 мл в пробірку і виконати наступне:
I. Осадження білка.
1. До розчину білка долити надлишок води. З'являється муть внаслідок нерастворимости даного білка в воді. Додати розчин (NH 4) 2 SO 4. Зникає чи каламуть.
2. Нагріти розчин білка до кипіння. Розчиняється осад після охолодження?
3. Висолювання білка. Всипати в пробірку з розчином білка суху сіль (NaCl) до появи каламуті, а потім долити води. Чи переходить осад в розчин.
4. Додавати до розчину білка по краплях концентровану HNO 3 (реакцію проводити в витяжній шафі) до випадання осаду внаслідок денатурації білка. Розчиняється осад після додавання розчину (NH 4) 2 SO 4.
II. Кольорові реакції на білок.
1. Ксантопротеиновая реакція на присутність в білку ароматичних амінокислот (тирозин, фенілаланіну, триптофану). Додати до розчину білка міцну HNO 3 і обережно нагріти до кип'ятіння. Відміряти забарвлення згустку білка. Після охолодження обережно додати по краплях (по стінці пробірки) розчин аміаку і відзначити зміну забарвлення.
2. Біуретова реакція на пептидний зв'язок - CO - NH. Долити до розчину білка вдвічі менший обсяг 10% - ного розчину NaOH і 1 - 2 краплі 1% - ного розчину CuSO 4. В який колір забарвлюється розчин.
3. Реакція на сірку амінокислот цистеїну і цистину. До розчину білка додати вдвічі більший обсяг 10% - ного розчину NaOH і обережно кип'ятити 2 - 3 хв. Потім внести кілька крапель розчину оцтовокислого свинцю і продовжити нагрівання до випадання чорного осаду. Написати рівняння реакції між Na 2 S. утворюється при витісненні сірки з білка лугом, і оцтовокислим свинцем. Описати реакції з відповідними поясненнями.
Робота 8. Явища плазмолізу і деплазмолізу
Матеріали та обладнання: 1) цибулина синього лука або листя традесканції, 2) 1 М розчин сахарози в крапельниці, 3) лезо бритви, 4) скальпель, 5) пінцет, 6) препаровальной голка, 7) мікроскоп, 8) предметні і покривні скла , 9) стакан з кип'яченою водопровідною водою, 10) скляна паличка, 11) шматочки фільтрувального паперу, 120 спиртівка, 13) сірники.
Рослинну клітину можна розглядати як осмотичну систему, в якій роль розчину осмотично діючих речовин грає клітинний сік, а роль напівпроникною перетинки - цітоплазмотіческіе мембрани. Клітинний сік, як будь-який розчин, має потенційні м осмотичним тиском, яке прямо пропорційно числу частинок в одиниці об'єму незалежно від розмірів і характеру цих частинок (молекули, іони). Розчин, відокремлений від чистої води напівпроникною перетинкою (пропускає воду і непроникною для розчинених речовин), смокче воду з силою, чисельно рівний його потенційному осмотичного тиску, т. Е. Тиску, яке потрібно прикласти, щоб перешкодити пересуванню води в сторону розчину. Для кожної клітини можна підібрати такі розчини: 1) гіпотонічний, осмотичний тиск якого менше осмотичного тиску клітинного соку, 2) ізотонічний, що має осмотичний тиск, що дорівнює осматіческому тиску клітинного соку, 3) гіпертонічний, осматіческое тиск якого більше ніж тиску клітинного соку
При зануренні клітини в гіпертонічний розчин вода з неї виходить назовні до вирівнювання осмотичних тисків клітинного соку і зовнішнього розчину. При цьому клітина прітерпівает наступні зміни: Спочатку вона скорочується, а після повної втрати тургору протопласт відстає від клітинної стінки по кутах (кутовий плазмоліз), потім у багатьох місцях (увігнутий плазмоліз) і, нарешті, протопласт округляється (опуклий плазмоліз). Утворені простору між протопластом і клітинною стінкою (добре проникною як для води, так і для розчинених речовин) заповнюється зовнішнім розчином. Як плазмалітіков (речовин, розчини яких викликає плазмоліз) використовують не отруйні речовини, погано проникають або не проникає через цитоплазму в вакуоль. Плазмоліз - оборотний процес. Зникнення плазмолізу називається деплазмолізу.
Хід роботи. Зрізати бритвою шматочок епідермісу, клітини якого містять антоціан.
Щоб уникнути пошкодження клітин епідермісу бажано, щоб зріз складався з 2 шарів клітин.
Помістити зріз в краплю, води на предметне скло накрити покривним склом і розглянути в мікроскоп клітини з пофарбованим клітинним соком. Замінити воду 1М розчином сахарози, для чого на предметне скло поруч з покривним нанести велику краплю розчину і відсмоктати воду шматочком фільтрувального паперу, прикладаючи його з іншого боку покривного скла. Повторити цей прийом 2 3 рази до повної заміни води розчином. Весь час стежити в мікроскоп за тим, що відбувається в клітинах.
Зробити схематичні малюнки клітин в стані тургору, уголкового, увігнутого і опуклого плазмолізу, визначивши основні складові частини клітин
Ввести під покривне скло 2-3 краплі води, відсмоктуючи розчин фільтрувального паперу, і негайно приступити до спостереження деплазмолізу клітин. Після закінчення деплазмолізу вбити клітини, тримаючи край предметного скла пінцетом і обережно нагріваючи препарат на полум'ї спиртівки, не допускаючи випаровування води. Потім воду на 1М розчин сахарози і, розглядаючи препарат в мікроскоп встановити, чи відбувається плазмоліз
Записати результати спостереження відповісти на наступні питання.
1. Що таке плазмоліз і які його причини.
2. Як відбувається деплазмолізу?
3. Чи здатні плазмолізіровать мертві клітини?
Работа12.Определеніе життєздатності насіння методом фарбування (по)
Матеріали та обладнання: 1) насіння гороху, намочені у воді за 10 - 15 год до заняття, 2) 0,1% - ний розчин индигокармина (1 г на 1 л дистильованої води), 3) чашки порцелянові (2 шт), 4 ) стакан хімічний, 5) стакан фаянсовий з вологою тирсою, 6) тарілка, 7) препаровальной голка, 8) електроплитка, 9) олівець по склу.
Метод фарбування насіння для визначення їх схожості на непроникності живий цитоплазми для деяких фарб (індигокармін, кислий фуксин), тоді як мертва цитоплазма легко фарбується. Бувають випадки, коли зародок мертвий і тим не менше при зануренні насіння в розчин фарби він не забарвлюється через те, що навколишні зародок частини насіння не пропускають фарбу. У зв'язку з цим необхідно попередньо оголити зародок, у насіння з ендоспермом видалити насіннєві покриви.
Підготовлені описаним способом насіння витримуються в розчині фарби від 1 до 3 год (в залежності від виду рослин) і оцінюють життєздатність насіння: насіння з щільністю пофарбованими зародками або з пофарбованими корінцями вважають невсхожімі, насіння забарвлені або з частково пофарбованими сім'ядолями відносять до числа життєздатних.
Даний метод використовують для швидкої оцінки схожості насіння гороху, квасолі, люпину, льону, конопель, гарбузових.
Хід роботи. Відрахувати, не добираючи, дві порції по 10 набряклих насіння гороху. Одну порцію помістити в стакан з водою і прокип'ятити протягом 5 хв. Обережно, не пошкоджуючи сім'ядолі, очистити препаровальной голкою насіння обох порцій від шкірки, помістити в порцелянові чашки, залити розчином индигокармина і витримати 1 ч, після чого злити фарбу назад в пляшку, а насіння відмити водою від надлишку барвника.
Відзначити забарвлення насіння, убитих шляхом кип'ятіння. У дослідній порції підрахувати кількість забарвлених, частково пофарбованих і нефарбованих насіння. Для перевірки схожості висадити всі 10 насіння в стакан з вологою тирсою (перед набиванням склянки віджати з тирси надлишок води) поставити в темний шафа і щодня поливати. Через кілька днів підрахувати кількість пророслого насіння. Результати записати в таблицю.
Зіставити результати, отримані методом фарбування і методом пророщування.
Робота 13. Накопичення метиленової синьої в клітинах Елоді
Матеріали та обладнання: 1) пагони Елоді довжиною близько 10 см, 2) розчин мітіленовой синьою 1: 50мг в 1 л водопровідної води), 3) 1 М розчин KNO 3 в крапельниці, 4) пінцет, 5) штатив із пробірками (2 шт ), 6) мікроскоп, 7) предметне і покривне скло, 8) смужки фільтрувального паперу.
У попередніх роботах було продемонстровано найважливіше властивість цитоплазми - напівпроникливості, т. Е здатність легко пропускати воду і затримувати розчинені речовини. Однак цитоплазма не володіє ідеальною напівпроникливості, вона пропускає не тільки воду, але і багато речовин, причому деякі з них зі значною швидкістю. До числа таких речовин відноситься метиленовая синя, яка досить швидко проникає в рослинні клітини. Тканини деяких рослин здатні накопичувати велику кількість метиленової синьої аж до майже повного вилучення її з зовнішнього розчину внаслідок хімічного зв'язування фарби містяться в клітинах дубильними речовинами, причому нерідко утворюються невеликі сині кристали.
Хід роботи. Заповнити дві пробірки розчином метиленової синьої. Помістити в одну пробірку 2 3 втечі Елоді, другу залишити в якості контролю. Через 2-3 год (або через добу) відзначити зміну інтенсивності забарвлення в посудині з рослинами в порівнянні з контролем (розглядати на світлому фоні). Помістити 1-2 інтенсивно забарвлених листочка на предметне скло в краплю 1 М розчину KNO 3, накрити покривним склом і через 15-20 хв розглянути в мікроскоп при великому збільшенні. Замалювати плазмолізірованную клітку.
Відповісти на наступні питання.
1.В якій частині клітини накопичується метиленовая синя?
2. Як пояснити відсутність зворотної дифузії поглинання фарби з клітин в зовнішній розчин?
3.Остаются чи клітини живими після накопичення в них метиленової синьої?
Робота 11. Різна проникність плазмалемми і тонопласта
Матеріали та обладнання: 1) цибулина звичайного лука, 2) 1 М розчин KNO 3 з еозином в крапельниці, 3) мікроскоп, 4) лезо бритви, 5) препаровальной голка, 6) предметні і покривні скла, 7) кольорові олівці.
Зовнішня цитоплазматична мембрана (плазмалемма) володіє більш високою проникністю, ніж тонопласт. У цьому можна переконатися, спостерігаючи набухання цитоплазми під впливом накопичуються в ній іонів калію.
Хід роботи. Нанести на предметне скло велику краплю 1М розчину KNO 3 з еозином, занурити в неї 2-3 шматочки безбарвного епідермісу м'ясистої луски цибулі і закрити покривним склом. Через 3 хв почати спостереження під мікроскопом плазмолізірованних клітин. Не допускати підсихання препарату, вводячи час від часу свіжі краплі розчину.
Спочатку цитоплазма оточує вакуоль тонким шаром, але незабаром починається її набухання (ковпачковий плазмоліз), а потім поступово відмирання і фарбування під дією еозину, який проник через плазмалему. Чи збільшується при цьому обсяг вакуолі і забарвлюється чи клітинний сік.
Описати спостережувані явища, замалювати клітку в стані ковпачкового плазмолізу і розфарбувати кольоровим олівцем.
У висновках зіставити проникність плазмалемми і тонопласта для іонів крапля і еозину і пояснити причини набухання цитоплазми.
Робота 9. Визначення в'язкості цитоплазми за часом плазмолізу
Матеріали та обладнання: 1) гілочки Елоді, 2) цибулина синього лука або листя трандесканціі, 3) 0,8 М розчин сахарози в крапельниці, 4) лезо бритви, 5) препаровальной голка, 6) пінцет, 7) мікроскоп, 8) предметні і покривні скла.
Проміжок часу від моменту занурення клітин в гіпертонічний розчин до появи опуклого плазмолізу називають часом плазмолізу. Цей час залежить від в'язкості цитоплазми: чим менше в'язкості, тим легше цитоплазма відстає від клітинної стінки і тим швидше увігнутий плазмоліз переходить в опуклий. В'язкість цитоплазми залежить від ступеня дисперсності і гідратації колоїдів. змісту в клітці води і ряду інших чинників. Цитоплазма зростаючих клітин і клітин, які закінчили ріст, має різну в'язкість.
Для досвіду використовуються молоді листочки Елоді, в яких можна розрізнити чотири зони: в підставі розташована слабо забарвлена зона поділу клітин, вище знаходиться зона розтягування, ще вище -Зона диференціювання і, нарешті, верхівка листа, яка складається з клітин, які закінчили своє зростання і мають інтенсивно зелене забарвлення.
Хід роботи. Взяти 2-3 молодих листочка з верхівкової частини пагона Елоді (листя повинні мати зелений кінчик і блідо - зелене підставу), занурити в краплю 0,8 М розчину сахарози на предметному склі і закрити покривним склом. Для порівняння в іншу краплю розчину сахарози помістити зріз епідермісу синього лука або традесканції. Відзначити час занурення досліджуваних об'єктів в розчин. Розглядаючи препарати в мікроскоп через кожні 5 хв, визначити час плазмолізу, причому у листа Елоді слід спостерігати за клітинами різних зон. Записати результати і зробити висновок про залежність в'язкості цитоплазми від віку клітини.