Виявлення в сироватці крові біль-ного антитіл проти антигенів збудників-ля дозволяє поставити діагноз хвороби. Серологічні дослідження застосовують також для ідентифікації антигенів мікро-бов, різних біологічно активних ве-вин, груп крові, тканинних і пухлинних антигенів, імунних комплексів, рецепто-рів клітин та ін.
При виділенні мікроба від хворого про-водять ідентифікацію збудника шляхом вивчення його антигенних властивостей за допомогою імунних діагностичних сироваток, т. Е. Сироваток крові гіперімунізованих тварин, що містять специфічні ан-ника. Це так звана серологічна ідентифікація мікроорганізмів.
У мікробіології і імунології широко застосовуються реакції аглютинації, Прец-пітаціі, нейтралізації, реакції з долі третьому комплементу, з використанням мічених антитіл і антигенів (радіоіммунологічес-кий, імуноферментний, імунофлюоресцентний методи). Перераховані реакції розрізняються за реєстрованим ефекту і техніці постановки, проте, всі вони осно-вани на реакції взаємодії антигену з антитілом і застосовуються для виявлення як антитіл, так і антигенів. Реакції імунної-та характеризуються високою чувствітельнос-ма і специфічністю.
Особливості взаємодії антитіла з ан-тігеном є основою діагностичних реакцій в лабораторіях. Реакція in vitro між-ду антигеном і антитілом складається з спеці-фіческой і неспецифічної фази. У спеці-фического фазу відбувається швидке специфи-чеський зв'язування активного центру антитіла з детермінантою антигену. Потім настає неспецифічна фаза - більш повільна, ко-торая проявляється видимими фізичними явищами, наприклад освітою пластівців (феномен аглютинації) або преципитата у вигляді помутніння. Ця фаза вимагає наявності певних умов (електролітів, опти-мального рН середовища).
Зв'язування детермінанти антигену (епітопи) з активним центром Fab-фрагмента анти-тел обумовлено ван-дер-ваальсовими силами, водневими зв'язками і гідрофобним взаємо-дією. Міцність і кількість связавше-гося антигену антитілами залежать від афінності-ності, авідності антитіл і їх валентності.
До питання про експрес-діагностику:
1. Діагностиці піддається культура виділена в чистому вигляді.
2. У Спеціально оснащених лабораторіях (повинно бути дозвіл)
3. Дотримання строгих правил таких як: ізольоване приміщення, необхідні спеціальні захисні костюми, обов'язкова повна санітарна обробка приміщення після роботи із збудником, санітарна обробка дослідників після закінчення роботи.
Методи експерсс-діагностики.
1.Бактеріологія - комбіновані Політропний поживні середовища для швидкого вивчення морф, тінктор, биохим. властивостей. Використання ензімоіндікаторной стрічки, електрофізичний метод, метод паперових дисків, просочених різними в-вами (глюказо, лактоза і т.п.)
2.Фагодіагностіка.
3.Серодіагностіка - метод Манчіні, раекциями преципитации в гелі по Асколі, РА, РПГА.
4. Бактериоскопия - прям і Непра РИФ.
Методи експрес діагностики при:
Холері - м.З.Ермольевой, р-ція іммобілізації з холерної діагностичної сироваткою, РІФ.
Туляремії - РА на склі, РПГА
Чумі - фаготіпірованіе, метод вуглеводних паперових дисків, РПГА.
Сіб.язва - метод Асколі, РІФ, РПГА.
Характер зростання. їх три дифузний (факультативні анаероби), придонний (облігатні анаероби) і поверхневий (облігатні аероби.)
Виділення чистої культури анаеробних бактерій
У лабораторній практиці часто доводиться працювати з анаеробними мікроорганізмами. Вони більш вибагливі до живильних середовищ, ніж аероби, частіше потребують спеціальних ростових добавках, вимагають припинення доступу кисню при їх культивуванні, тривалість зростання їх довше. Тому робота з ними більш складна, вимагає значної уваги бактеріологів і лаборантів.
Важливою є захист матеріалу, який містить анаеробні збудники від токсичного впливу атмосферного кисню. Тому матеріал з вогнищ гнійної інфекції рекомендується забирати під час їх пункції за допомогою шприца, час між взяттям матеріалу і посівом його на живильне середовище повинно бути максимально коротким.
Оскільки для культивування анаеробних бактерій використовують спеціальні живильні середовища, які не повинні містити кисню і мають низький окислювально відновний потенціал (-20 -150 мВ), до їх складу вводять індикатори - резазуріна, метиленовий синій тощо, які реагують на зміну цього потенціалу. При його зрості відновлені безбарвні форми індикаторів змінюють свій колір: резазуріна забарвлює середу в рожевий колір, а метиленовий синій - в блакитний. Такі зміни свідчать про неможливість використання середовищ для культивування анаеробних бактерій.
Сприяє зниженню окисно відновного потенціалу введення в середу не менше 0,05% агару, який, збільшуючи його в'язкість, сприяє зменшенню надходження кисню. Це, в свою чергу, досягається ще й використанням свіжих (пізніше двох годин після виготовлення) та редукованих поживних середовищ.
Слід врахувати, що через особливості бродильного типу метаболізму анаеробних бактерій вони вимагають більш багатих на поживні компоненти та вітаміни середовищ. Найчастіше використовують серцево мозкової і печінковий настої, соєві і дріжджові екстракти, гідролітичного перевар казеїну, пептони, триптон. Обов'язковою є додавання факторів росту, таких як твін-80, гемін, менадион, цільна або гемолізовані кров.
Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з ряду етапів.
У перший день (1 етап дослідження) в стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал. Його вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом та іншим ознаками, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища, на які буде засіватися матеріал. Зайняв проводять бактеріологічною петлею (застосовується найчастіше), за допомогою шпателя за методом Дрігальского, ватно-марлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять в термостат при оптимальній температурі (37 ° С) на 18-48 рік. Мета етапу - отримати ізольовані колонії мікроорганізмів.
Однак, часом з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі поживні середовища.
З підозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грамма для вивчення морфологічних і тинкторіальними властивостей збудників, досліджують рухливу бактерій в "висячої" або "роздавлений" краплі. Ці ознаки мають надзвичайно велике діагностичне значення при характеристиці окремих видів мікроорганізмів.
Залишки досліджуваних колоній обережно, не торкаючись інших, знімають з поверхні середовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі з живильним середовищем для отримання чистої культури. Пробірки або чашки з посівами поміщають в термостат при оптимальній температурі на 18-24 години.
На рідких поживних середовищах бактерії також можуть рости по-різному, хоча особливості проявів зростання бідніші, ніж на щільних.
Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому може не змінюватися або набуває кольору пігменту. Такий характер зростання найчастіше спостерігається в більшості факультативно анаеробних мікроорганізмів.
Часом відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може бути крошкообразную, гомогенним, в'язким, слизових тощо. Серед над ним може залишатися прозорою або ставати каламутній. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад має сірувато-білий або жовтуватий колір. Подібним чином ростуть, як правило, анаеробні бактерії.
Пристінковий зростання проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище за цьому залишається прозорою.
Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або синюватий наліт у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в'язку, слизову консистенцію і прилипати до петлі, тягнеться за нею. Однак, зустрічається і щільна, суха, тендітна плівка, колір якої залежить від пігменту, який виробляється мікроорганізмами.
У разі необхідності виготовляється мазок, забарвлюється, досліджується під мікроскопом, а мікроорганізми засіваються петлею на поверхню щільного поживного середовища для отримання ізольованих колоній.
На третій день (3 етап дослідження) вивчають характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію.
Спочатку звертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі і роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів і тинкторіальними (здатність фарбуватися) властивостей, роблять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже за зовнішнім виглядом і особливостями їх росту можна зробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфологічної ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральной ідентифікацією.
Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених мікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони досить різноманітні.
Найчастіше досліджують сахаролитические, протеолітичні, пептолітіческіе, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, каталази, плазмокоагулази, ДНК-ази, фибринолизина, відновлення нітратів в нітрити тощо. Для цього існують спеціальні живильні середовища, які засівають мікроорганізмами (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко і ін.).
Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями називається біохімічної ідентифікацією.
МЕТОДИ культивування
І ВИДІЛЕННЯ ЧИСТОЇ КУЛЬТУРИ БАКТЕРІЙ
Для успішного культивування, крім правильно підібраних середовищ і правильно проведеного посіву, необхідні оптимальні умови: температура, вологість, аерація (постачання повітрям). Культивування анаеробів складніше, ніж аеробів, для видалення повітря з живильного середовища використовують різні способи.
Виділення окремих видів бактерій (чистої культури) з досліджуваного матеріалу, що містить, як правило, суміш різних мікроорганізмів, є одним з етапів будь-якого бактеріологічного дослідження. Чистої культурою мікробовполучают з ізольованою мікробної колонії.
При виділенні чистої культури з крові (гемокультури) її попередньо «підрощують» в рідкому середовищі: 10-15 мл стерильно взятої крові засівають в 100-150 мл рідкого середовища. Співвідношення засеваемой крові і живильного середовища 1:10 не випадково - так досягається розведення крові (нерозведена кров згубно діє на мікроорганізми).
Етапи виділення чистої культури бактерій
I етап (нативний матеріал)
Мікроскопія (орієнтовний уявлення про мікрофлору).
Посів на щільні поживні середовища (отримання колоній).
II етап (ізольовані колонії)
Вивчення колоній (культуральні властивості бактерій).
Мікроскопічне вивчення мікробів в пофарбованому мазку
(Морфологічні властивості бактерій).
Посів на скошений поживний агар для виділення чистої культури.
III етап (чиста культура)
Визначення культуральних, морфологічних, біохімічних
та інших властивостей для ідентифікації культури бактерій
ІДЕНТИФІКАЦІЯ бактерій
Ідентифікацію виділених бактеріальних культур проводять шляхом вивчення морфології бактерій, їх культуральних, біохімічних та інших ознак, притаманних кожному виду.