Тема: Лабораторна діагностика дифтерії.
Мета: На основі знань біології коринебактерий дифтерії, особливостей їх взаємодії з макроорганизмом вміти обгрунтувати тактику мікробіологічної діагностики, профілактику і терапію викликаний ними захворювання.
1. Класифікацію і морфобіологічні особливості збудника дифтерії.
2. Екологію, особливості патогенезу та імунітету при дифтерії.
3. Матеріал і методи мікробіологічної діагностики дифтерії.
4. Методи визначення антитоксичну імунітету при дифтерії.
5. Специфічну профілактику і терапію дифтерії.
1. Проводити забір матеріалу із зіву, носа і його посів на кровяно-телуритовий агар з метою виявлення бактеріоносійства збудника дифтерії.
2. Ідентифікувати і диференціювати збудника дифтерії від дифтероїдів.
3. Пофарбувати препарат з культури збудника дифтерії за методом Нейссера, промікроскопувати і інтерпретувати отриманий результат.
4. Враховувати, оцінювати результати РП в гелі для визначення токсигенності коринебактерій дифтерії.
5. Визначати рівень антитоксичну імунітету (РНГА).
1. Класифікація і морфобіологічні особливості збудника дифтерії.
2. Фактор патогенності збудника дифтерії та механізм його дії.
3. Джерела інфекції, шляхи зараження, особливості патогенезу та імунітету при дифтерії.
4. Визначення антитоксичну імунітету при дифтерії (РНГА).
5. Матеріал і методи мікробіологічної діагностики дифтерії.
6. Мета, техніка постановки і оцінка результатів РП в гелі при діагностиці дифтерії.
7. Специфічна профілактика і терапія дифтерії.
Завдання, що виконуються в ході заняття (УИРС):
1. Провести бактеріологічне дослідження на дифтерію у обстежуваних з клінічним діагнозом «дифтерія ротоглотки», для чого:
1.1. Вивчити посіви виділень із зіву і носа на кровяно-телуритовий агарі, відібрати і описати характерні ізольовані колонії.
1.2. Вивчити характер росту і морфотінкторіальние властивості культур (забарвлення по Граму і Нейссеру), виділених з характерних колоній на сироватковому агарі від тих же хворих.
1.3. Врахувати і оцінити результати посіву досліджуваних культур на «строкатий ряд» (глюкоза, сахароза, крохмаль, сечовина, цистин).
1.4. Врахувати і оцінити РП в гелі досліджуваних культур з антитоксической протидифтерійної сироваткою.
На підставі отриманих результатів визначити вид виділеної культури, її токсигенность; заповнити бланк-направлення та бланк-відповідь з бак. лабораторії.
2. Продовжити бактеріологічне дослідження на бактеріоносійство коринебактерий дифтерії у студентів, для чого:
2.1. Вивчити посіви виділень із зіву на кровяно-телуритовий агарі, відібрати і описати характерні ізольовані колонії.
2.2. З відібраних колоній приготувати препарати, забарвить по Граму і Нейссеру, промікроскопувати.
На підставі отриманих результатів сформулювати висновок.
3. Поставити, врахувати і оцінити РНГА з сироватками обстежуваних і еритроцитарних дифтерійним антигенними діагностикумами для визначення антитоксичну імунітету.
4. Охарактеризувати біопрепарати: АКДС, АДС, АДС-М, антитоксическая противодифтерийная сироватка.
Методичні вказівки до виконання дослідницького завдання:
I. Проведіть бактеріологічне дослідження по виділенню збудника дифтерії від хворих з клінічним діагнозом «дифтерія ротоглотки»:
1 етап. Успіх бактеріологічного дослідження залежить від своєчасного і правильного взяття матеріалу. Від хворих з ангінами і з підозрою на дифтерію забір матеріалу необхідно проводити протягом 3-4 годин з моменту звернення в ЛПУ до початку будь-якої терапії.
Матеріалом служить слиз і плівки з мигдалин із зіву і носа. Взяття матеріалу повинні проводити спеціально навчені медичні працівники.
Матеріал забирають стерильними ватяними сухими тампонами окремо для зіву і носа. Матеріал із зіву забирають натщесерце або не раніше, ніж через 2 години після їжі; при хорошому освітленні з використанням шпателя, не торкаючись тампоном мови, слизових щік і зубів. При наявності нальотів матеріал слід брати з кордону уражених і здорових тканин, злегка натискаючи на них тампоном. Для взяття матеріалу з носа використовують один тампон, який вводять спочатку в один, а потім в інший носовий хід, не торкаючись крил носа зовні.
Посів від одного обстежуваного виробляють на одну чашку з кровяно-телуритовий агаром (КТА), використовуючи при цьому одну половину для посіву матеріалу із зіву, другу - для посіву матеріалу з носа.
При посіві матеріал втирають в середу з усіх боків тампоном на ділянці площею 2х1 см 2. а потім цим же тампоном, не змінюючи положення, проводять посів відривними лініями. Чашки інкубують при температурі 37 ° С 24-48 ч.
Посів слід проводити на чашки з КТА, зігріті при кімнатній температурі або в термостаті протягом 15-20 хв.
На 2 етапі оціните результати посіву досліджуваного матеріалу із зіву і носа тих же хворих на КТА. Дайте характеристику виросли колоній, відберіть і опишіть в протоколі ті колонії, характеристика яких співпадає з такою передбачуваного збудника. Сформулюйте відповідь.
На КТА C. diphtheriae v. gravis утворюють сірувато-чорні колонії діаметром 2-3 мм, плоскі, з радіальної смугастість (R-форма); C. diphtheriae v. mitis - чорні, матові, діаметром 1-2 мм, опуклі, з рівними краями (S-форма). У препаратах коринебактерии дифтерії - це грампозитивні поліморфні, прямі і злегка зігнуті палички, розташовані під кутом або у вигляді розчепірених пальців, а також утворюють скупчення, що нагадують повсть. При фарбуванні за Нейссеру виявляються темно-сині зерна волютина, розташовані на кінцях клітин. Діфтероіди, в основному, розташовуються «частоколом» і зазвичай позбавлені зерен волютина.
Характерні колонії відсіваються на скошений сироватковий агар, середовище Пізу і ставлять РП на токсигенность. Посіви поміщають в термостат при 37 ° С на 18-24 години.
На 3 етапі врахуйте результати РП в гелі і проби Пізу. У разі позитивної РП і проби Пізу на цистиназу, видають відповідь лікаря, що виділена токсигенних дифтерійна культура.
Вивчіть зростання культури, відсіяти з колоній передбачуваного збудника, на скошеному сироватковому агарі. Приготуйте фіксований препарат з досліджуваної культури, пофарбуйте по Нейссеру (оцтово-кислий синька Нейссера - 60 с, змити; розчин Люголя - 30 с, злити; хрізоідін - 10-15 с, змити; висушити) і промікроскопіруйте. Отримані результати внесіть в протокол.
Виділену чисту культуру засівають на середовища Гіссен з глюкозою, сахарозою, крохмалем, цистином (проба Пізу) і сечовиною (проба Закса), а також ставлять знову РП.
На 4 етапі врахуйте і оціните результати роботи на 3 етапі дослідження:
- біохімічну активність виділеної культури на середовищах Гісса, середовищі Пізу (цистиназу) і середовищі Закса (уреаза);
- РП в агарових гелі, звернувши увагу на достовірність отриманих результатів.
За результатами всіх етапів дослідження встановіть вид збудника, його біовар; визначте його токсигенность і заповніть бланк-направлення та бланк-відповідь з бак. лабораторії.
II. Продовжіть бактеріологічне дослідження на бактеріоносійство коринебактерий дифтерії у студентів, для чого:
Вивчіть посіви виділень із зіву і носа на кровяно-телуритовий агарі, відберіть і опишіть характерні ізольовані колонії.
З відібраних колоній приготуйте препарати, пофарбуйте по Граму і Нейссеру, промікроскопіруйте.
На підставі отриманих результатів сформулюйте висновок.
III. Поставте, врахуйте і оціните РНГА з сироватками обстежуваних і еритроцитарних дифтерійним антигенними діагностикумами для визначення антитоксичну імунітету.
Визначення рівня антитоксичну імунітету здійснюється для оцінки ефективності і якості проведення прищеплювальної роботи. З цією метою обстежується індикаторна група населення, що включає в себе осіб, що мають документально підтверджених прищеплювальний анамнез і отримали останнє щеплення за 6-18 міс. до обстеження.
Для цієї мети ставиться РНГА в полістиролових планшетах (див. Таблицю №1).
Схема постановки РНГА для визначення антитоксичну імунітету
Експозиція 30-40 хв при кімнатній температурі
Планшети залишають на рівній поверхні при Т-20 ° С; їх переміщення до обліку результатів реакції не допустимо!
Облік результатів РНГА здійснюється візуально в хрестах за ступенем аглютинації еритроцитів (див. Заняття №10). В контролях повинен бути відсутнім феномен гемаглютинації. Титром сироватки є останнє розведення, що дає реакцію гемаглютинації не менше ++. Для оцінки результатів використовують захисний титр, рівний 1:20.
IV. Ознайомтеся і опишіть в протоколі біопрепарати, вказавши, що вони містять, для чого і як застосовуються.