№ 20Іскусственние поживні середовища, їх класифікація. Вимоги, що пред'являються до живильних середовищ.
Живильним середовищем в мікробіології називають середовища, содер-жащие різні сполуки складного або простого складу, які застосовуються для розмноження бактерій або інших мікроорганізмів в лабораторних або промислових умовах.
Живильні середовища готують з продуктів тваринного або рас-тітельного походження. Велике значення має наявність в живильному середовищі ростових факторів, які каталізують метаболічні процеси мікробної клітини (вітаміни груп-пи В, нікотинова кислота та ін.).
Штучні середовища готують за певними рецептами з різних настоїв чи відварів тваринного або рослинного про-виходи з додаванням неорганічних солей, вугле-водів і азотистих речовин.
В бактеріологічній практиці найчастіше використовують сухі поживні середовища, які отримують на основі досягнень сучасної біотехнології. Для їх приготування використовують економічно рентабельне нехарчове сировину: втратили термін придатності кровозамінники (гидролизин-кислотний гідролізат крові тварин, аминопептид - ферментативний гідролізат крові; продукти біотехнології (кормові дріжджі, кормовий лізин, виноградна борошно, белколізін). Сухі поживні середовища можуть зберігатися протягом тривалого часу, зручні при транспортуванні і мають відносно стандартний склад.
За консистенцією поживні середовища можуть бути жид-кими, напіврідкими, щільними. Щільні середовища готують шляхом до-додану до рідкому середовищі 1,5-2% агару, напіврідкі - 0,3- 0,7% агару. Агар є продукт переробки осо-бого виду морських водоростей, він плавиться при температурі 80-86 ° С, твердне при температурі близько 40 ° С і в завмерши-шем стані надає середовищі щільність. У деяких випадках для отримання щільних поживних середовищ використовують желатин (10-15%). Ряд природних поживних середовищ (згорнута си-воротка крові, згорнутий яєчний білок) самі по собі є щільними.
За цільовим призначенням середовища поділяють на основні, елективні та диференціювання ально-діагностичні.
До основних відносяться середовища, що застосовуються для вирощування багатьох бактерій. Це триптичного гідролізати м'ясних, рибних продуктів, крові тварин або казеїну, з яких готують рідку середу - живильний бульйон і щільну - поживний агар. Такі середовища є основою для приготов-лення складних поживних середовищ - цукрових, кров'яних і ін. Задовольняють харчові потреби патогенних бак-терій.
Електівниє поживні середовища призначені для виборчі-ного виділення і накопичення мікроорганізмів визначено-ного виду (або певної групи) з матеріалів, утримуючи-щих різноманітну сторонню мікрофлору. При створенні елективних поживних середовищ виходять з біологічних особ-ностей, які відрізняють дані мікроорганізми від блешні-ства інших. Наприклад, виборчий зростання стафілококів на-блюдается при підвищеній концентрації хлориду натрію, хо-Лерна вібріона - в лужному середовищі і т. Д.
Диференційно-діагностичні поживні середовища при-змінюються для розмежування окремих видів (або груп) мік-роорганізмов. Принцип побудови цих середовищ заснований на тому, що різні види бактерій розрізняються між собою по БіоХім-мической активності внаслідок неоднакового набору фермен-тов.
Особливу групу складають синтетичні і полусінтетіче-ські поживні середовища. До складу синтетичних середовищ входять хімічно чисті речовини: амінокислоти, мінеральні солі, вуглеводи, вітаміни. У напівсинтетичні середовища додатково включають пептони, дріжджовий екстракт і інші поживні речовини. Ці середовища найчастіше застосовують в науково-досліджень-тельской роботі і в мікробіологічної промисловості при отриманні антибіотиків, вакцин і інших препаратів.
В останні роки з метою економії поживних середовищ і уско-ренной ідентифікації деяких мікроорганізмів (ентеробактерії, стафілококи, стрептококи та ін.) Застосовуються так на-зване Мікротест-системи (МТС). Вони являють собою полістиролові пластини з лунками, в яких містяться сте-рільним диференційно-діагностичні середовища. Стерилізацію МТС проводять УФ-опроміненням. Мікротест-системи особливо зручні при масових бактеріологічних дослідженнях в практичних лабораторіях.
Вимоги, що пред'являються до живильних середовищ.
Будь-яка живильне середовище повинна відповідати наступним тре-бованіям: містити всі необхідні для розмноження мікроорганізмів речовини в легкозасвоюваній формі; мати оптимальні вологість, в'язкість, рН, бути Ізотонічність і по воз-можности прозорою. Кожну живильне середовище стерилізують певним способом в залежності від її складу.
№ 21Прінціпи і методи виділення чистих культур бакте-рій.
Чистої культурою називається популяція бактерій од-ного виду або одного різновиду, вирощена на живильному середовищі. Багато видів бактерій підрозділяють за однією ознакою на біологічні варіанти - біовари. Біовари, що розрізняють-ся за біохімічними властивостями, називають хемоварамі. по анти-генним властивостями - сероварами. по чутливості до фагу - фаговаров. Культури мікроорганізмів одного і того ж виду, або биовара, виділені з різних джерел або в різний час з одного і того ж джерела, називають штамами. які зазвичай позначаються номерами або будь-якими сім-волами. Чисті культури бактерій в діагностичних бактерії-логічних лабораторіях отримують з ізольованих колоній, пересіваючи їх петлею в пробірки з твердими або, рідше, рідкими живильними середовищами.
Колонія являє собою видиме ізольоване скопа-ня особин одного виду мікроорганізмів, що утворюється в результаті розмноження однієї бактеріальної клітини на щільному живильному середовищі (на поверхні або в глибині її). Колонії бактерій різних видів відрізняються один від одного за своєю мор-фологіі, кольором та іншими ознаками.
Чисту культуру бактерій отримують для проведення диагно-стических досліджень - ідентифікації, яка досягається шляхом визначення морфологічних, культуральних, біохімічн-ських та інших ознак мікроорганізму.
Морфологічні та тинкторіальних ознаки бактерій вивчають при мікроскопічному дослідженні мазків, забарвлених різними методами, і нативних препаратів.
Культуральні властивості характеризуються живильник-ними потребами, умовами і типом росту бактерій на пліт-них і рідких поживних середовищах. Вони встановлюються по мор-фологіі колоній і особливостям зростання культури.
Біохімічні ознаки бактерій визначаються на-бором конститутивних і індуцибельних ферментів, властивих певного роду, виду, варіанту. В бактеріологічній прак-тику таксономическое значення мають найчастіше сахаролитические і протеолітичні ферменти бактерій, які визначаються-ють на диференційно-діагностичних середовищах.
При ідентифікації бактерій до роду та виду звертають ува-гу на пігменти, що забарвлюють колонії і культуральне середовище в різноманітні кольори. Наприклад, червоний пігмент обра-товують Serratia marcescens, золотистий пігмент - Staphylococcus aureus (золотистий стафілокок), синьо-зелений пігмент - Pseu-domonas aeruginosa.
Для встановлення биовара (хемовара, серовар, фаготип) проводять додаткові дослідження по виялвеніб відповідного маркера - визначення ферменту, антигену, чутливості до Фанам.
Методи виділення чистих культур бакте-рій.
Універсальним інструментом для виробництва посівів є-ється бактеріальна петля. Крім неї, для посіву уколом при-міняють спеціальну бактеріальну голку, а для посівів на чашках Петрі - металеві або скляні шпателі. Для посівів рідких матеріалів поряд з петлею використовують пасті-ровськ і градуйовані піпетки. Перші попередньо через готовляют з стерильних легкоплавких скляних трубочок, які витягають на полум'я у вигляді капілярів. Кінець ка-пілляра відразу ж запаюють для збереження стерильності. У пастерівських і градуювальних піпеток широкий кінець за-кривают ватою, після чого їх поміщають в спеціальні пенали або обгортають папером і стерилізують.
При пересеве бактеріальної культури беруть пробірку в ліву руку, а правою, обхопивши ватяну пробку IV і V пальцями, виймають її, проносячи над полум'ям пальника. Утримуючи дру-шими пальцями тієї ж руки петлю, набирають нею посівної ма-теріал, після чого закривають пробірку пробкою. Потім в пробірку зі скошеним агаром вносять петлю з посівним матеріалом, опускаючи її до конденсату в нижній ча-сти середовища, і зигзагоподібним рухом розподіляють мате ріал по скошеної поверхні агару. Вийнявши петлю, обпалюють край пробірки і закривають її корком. Петлю стерилізують в полум'ї пальника і ставлять в штатив. Пробірки з посівами надг підписується, вказуючи дату посіву і характер посівного мате-ріалу (номер дослідження або назва культури).
Посіви «газоном» виробляють шпателем на поживний агар в чашці Петрі. Для цього, відкривши лівою рукою кришку, пет-лей або піпеткою наносять посівний матеріал на поверхню поживного агару. Потім проводять шпатель через полум'я горіло-ки, остуджують його про внутрішню сторону кришки і розтирають матеріал по всій поверхні середовища. Після інкубації посіву з'являється рівномірний суцільний ріст бактерій.
№ 22Ферменти бактерій. Ідентифікація бактерій за фер-ментатівной активності.
В основі всіх метаболічних реакцій в бактеріальної клітці лежить діяльність ферментів, які належать до 6 клас-сам: оксіредуктази, трансферази, гідролази, лігази, ліази, ізомерази. Ферменти, образу-ються бактеріальної клітиною, можуть локалі-тися як всередині клітини - ендоферменти, так і виділятися в навколишнє середовище - екзоферменти. Екзоферменти грають велику роль в забезпеченні бактеріальної клітини доступними для проникнення всередину ис-джерелами вуглецю і енергії. Більшість гидролаз є екзоферменти, які, виділяючись в навколишнє середовище, розщеплюючи-ють великі молекули пептидів, полісаха-рідов, ліпідів до мономерів і димерів, здатних проникнути всередину клітини. Ряд екзоферментів, наприклад гиалуронидаза, коллагеназа і інші, є ферментами агресії. Деякі ферменти локалізуються-вани в Периплазма бактеріальної клітини. Вони беруть участь в про-процесах перенесення речовин в бактеріальну клітину. Ферментативний спектр є таксономическим ознакою, характерним для сімейства, роду і - в деяких слу-чаях - для видів. Тому визначенням спектра ферментативної активності поль-ються при встановленні таксономічного положення бактерій. Наявність екзофермен-тов можна визначити за допомогою диференційно-діагностичних середовищ, тому для ідентифікації бактерій розроблені спеціальні тест-системи, що складаються з набору диференційно-діагностичних середовищ.
Ідентифікація бактерій за фер-ментатівной активності.
Найбільш ча-сто визначають ферменти класу гідролаз і оксидоредуктаз, використовуючи спеціальні методи і середовища.
Для визначення протеолітичної активності мік-роорганізми засівають в стовпчик желатину уколом. Че-рез 3-5 днів посіви переглядають і відзначають харак-тер розрідження желатину. При розкладанні білка деякими бактеріями можуть виділятися специфічні продукти - індол, сірководень, аміак. Для їх визна-лення служать спеціальні індикаторні папірці, ко-торие поміщають між шийкою і ватним корком в пробірку з МПБ або (і) пептонною водою, засіяними досліджуваними мікроорганізмами. Індол (продукт розлив-вання триптофану) забарвлює в рожевий колір смужку паперу, просоченої насиченим розчином щавлевої кислоти. Папір, просочений розчином ацетату свинцю, в присутності сірководню чорніє. Для визначення аміаку використовують червону лакмусовий папірець.
Для багатьох мікроорганізмів таксономическим при-знаком служить здатність розкладати певні вуглеводи з утворенням кислот і газоподібних продук-тов. Для виявлення цього використовують середовища Гіссен, со-тримають різні вуглеводи (глюкозу, сахарозу, маль-тозу, лактозу і ін.). Для виявлення кислот в середу доданий реактив Андреде, який змінює свій колір від блідо-жовтого до червоного в інтервалі рН 7,2-6,5, тому набір середовищ Гісса з ростом мікроорганізмів називають «строкатим поруч».
Для виявлення газообр-тання в рідкі середовища опускають поплавці або викорис-товують напіврідкі середовища з 0,5% агару.
Для того щоб оп-рідшали інтенсивне кислотообразование. характерне для бродіння змішаного типу, в середу з 1% глюкози і 0,5% пептона (середа Кларка) додають індикатор метиловий червоний, який має жовтий колір при рН 4,5 і вище, і червоний прі більш низьких значеннях рН.
Гідроліз сечовини визначають по виділенню ам-Міака (лакмусовий папірець) і подщелачиванию середовища.
При ідентифікації багатьох мікроорганізмів викорис-товують реакцію Фогеса - Проскауера на ацетоін - проме-жуточное з'єднання при утворенні бутандіолу з піровиноградної кислоти. Позитивна реакція свиде-ність про наявність бутандіолового бродіння.
Виявити каталазу можна за бульбашок кисню, які починають виділятися відразу ж після змішування-ня мікробних клітин з 1% розчином перекису водоростей-да.
Для визначення цитохромоксидази застосовують ре-активи: 1) 1% спиртовий розчин сс-нафтола-1; 2) 1% водний розчин N-диметил-р-фенілендіамін дигідро-хлориду. Про наявність цитохромоксидази судять по синьому фарбуванню, появ-рами через 2-5 хв.
Для визначення нітритів використовують реактив-тив Грісса: По-явище червоного забарвлення свідчить про наяв-ності нітритів.