Використання: біотехнологія, виробництво лимонної кислоти. Суть винаходу: новий штам продуцент лимонної кислоти - Aspergillus niger BKPMF-681. Штам отриманий шляхом селекції, має чорне забарвлення колоній, конідії діаметром 3,4-4,6 мкм. Відрізняється високою продуктивністю біомаси, утворює 11,8-18,7 г лимонної кислоти на 1 г повітряно-сухого міцелію. 1 табл.
Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості та селекції гриба Aspergillus niger -продуцента лимонної кислоти для ферментації глибинним способом середовищ: цукрово-мінеральних і отриманих в результаті гідролізу крохмалю, містять різну кількість глюкози.
Відомий природний штам гриба Asp. niger 82 (Д) продуцент лимонної кислоти для ферментації сахарозо-мінеральних середовищ. За 10 діб ферментації штам утворює 50-60% лимонної кислоти від витраченого цукру (1). При культивуванні на сусло-агарі штам 82 (Д) рясно утворює чорно-забарвлені конідії розміром 4,3 мкм.
Відомий продуцент лимонної кислоти Asp. niger S-59 (з колекції мікроорганізмів CCF 1600) для глибинного культивування на живильному середовищі, що містить 15% сахарози. Після 7 діб ферментації вихід лимонної кислоти досягає 70 75% від внесеного цукру (2).
Недоліком відомих штамів 82 (Д) і S-59 є порівняно низька продуктивність при тривалій ферментації.
Прототипом винаходу може служити відомий штам Asp. niger ВКПМF-501, призначений для глибинного культивування на сахарозо-мінеральних середовищах, який утворює лимонну кислоту з виходом від цукру 82,5% Штам має бежеву забарвлення конідій (3).
Недоліком штаму ВКПМF-501 є його потужний ріст, вимагає значних витрат цукру на формування біомаси на шкоду утворюється лимонній кислоті. Через рясний зростання вихід лимонної кислоти від витраченого цукру у культур штаму ВКПМF-501 недостатньо високий.
Нового селекціоновані штаму Aspergillus niger у Всеросійській колекції промислових мікроорганізмів присвоєно колекційний номер ВКПМF-681.
Культурально-МОРФОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ НОВОГО ШТАМУ ВКПМF-681 Aspergillus niger На 5 добу зростання на сусло-агарі гігантська колонія діаметром 90 мм. Колонія чорно-забарвлена. В радіусі 10 мм конідіеношеніе рясне. На решті частини колонії Конідіальниє головки утворюються групами, що не дуже щільно. "Стерильний" край колонії з незрілими конідіальной головками близько 5 мм. З підошви колонія в її центрі щільна, периферична частина колонії має тонкий міцелій.
Після 10 діб вирощування на сусло-агарі культура характеризується рясним дозріванням конідій. Конідіальниє головки від 54х54 мкм до 180х234 мкм в діаметрі, в середньому 119 мкм. Здуття конидиеносцев 34-39 мкм кулястої або поздовжньо витягнутої форми. Стеригмами двошарові. Довжина стеригм першого шару 9х2,3 11,5х4,6 мкм; довжина стеригмами другого шару 4,6 мкм. Конідії округлі, діаметр їх перетину 3,4-4,6 мкм, в середньому 3,99 мкм. Оболонка сіра, має безліч шипів. Конідієносці прямі, довжина їх 240-1000 мкм; середня довжина 450 мкм. Поперечний переріз конидиеносцев 19-34 мкм; в середньому 29 мкм.
Конідієносці нефарбовані, темно-коричневий пігмент накопичується у верхній частині конидиеносца, прилеглої до бульбашки.
У порівнянні з батьківським штамом 82 і вихідним 163/9 новий штам має меншу величину морфологічних структур (довжина конидиеносцев, здуття конидиеносцев, стеригмами другого шару, конідії): від прототипу бежевого штаму ВКПМ-501 відрізняється темно-сірим забарвленням конідій.
Штам Asp. niger ВКПМF-681 ідентифікований по визначник грибів роду Аспергіллус (4).
ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ Aspergillus Niger ВКПМF-581 Аероб, температура культивування 28-32 o C, pH 5,5 7,5.
Ставлення до джерел вуглецю: засвоює глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, в меншій мірі маннит, галактозу, сорбіт.
Ставлення до джерел азоту: засвоює азот органічних сполук, наприклад, білок, пептони, амінокислоти, дріжджовий автолізат, сечовину, асимілює солі амонію, нітрати.
Спосіб зберігання. Новий штам зберігається у вигляді повітряно-сухих конідій, відокремлених від культури гриба, вирощеної на сусло-агарі протягом 10 діб (6-7 діб при 32 o C і 3-4 діб при кімнатній температурі), охороняється від впливу прямих сонячних променів.
ГЕНЕТИЧНА ОСОБЛИВІСТЬ ШТАМУ-ПРОТОТРОФ Суть винаходу пояснюється наступними конкретними прикладами використання штаму ВКПМF-681.
Приклад 1. Для лабораторних випробувань посівний матеріал вирощують в пробірках на сусло-агарі; для напіввиробничих і виробничих випробувань посівний матеріал вирощують в кюветах на щільному живильному середовищі, приготовленої на основі пивного неохмеленного сусла, що містить 7% сухих речовин і ущільненої агар-агаром (20 г / дм 3), pH середовища 5,8. Висота шару середовища 12 13 мм. Стерильне середовище засівають конидиями елітної культури гриба і витримують в термостаті при 32 o C протягом 7 діб. Відносна вологість повітря в термостаті поступово знижується: перші четверо діб від 80 до 60% останні три доби від 60 до 40% Для повного дозрівання культуру гриба витримують при кімнатній температурі протягом 2 діб. Через 9-10 діб конідії знімають з поверхні грибних плівок за допомогою спеціального вакуумного пристрою.
Вологі конідії підсушують до залишкової вологості 5 8% Зберігають при кімнатній температурі.
Процес ферментації в лабораторних умовах проводять глибинним способом на гойдалці АВУ-50р з числом хитань 160-180 в хв. Температура повітря в качалочной кімнаті 32 o C.
Живильні середовища готують в колбах ємністю 750 мл; обсяг середовища 50 мл.
Культурою гриба, вирощеної на сусло-агарі протягом 10 діб або повітряно-сухими конидиями (10 7 конідій / см 3 середовища), засівають живильне середовище і протягом 2 діб вирощують посівної міцелій, Температура повітря в термокамері 30-32 o C.
Основною сировиною для приготування середовищ в даному прикладі є цукровий пісок.
Склад живильного середовища (г / л): цукор 50, меляса бурякова 17, нітрат амонію 2,5, сульфат магнію семиводний 0,25, дигідрофосфат калію 0,16, водопровідна вода до 1 л, pH 5,0 5,5.
Велика перевага нового штаму обмежений зростання і висока продуктивність міцелію, що досягає 18,7 г лимонної кислоти на 1 г повітряно-сухого міцелію за 5 діб ферментації; щавлеву кислоту штам не утворює; масова частка лимонної кислоти в сумі кислот становить 94-99% вихід лимонної кислоти від цукру витраченого на цикл 84-92,5% (див. табл.).
Новий штам є досить універсальним і пропонується для ферментації сахарозо-мінеральних середовищ і середовищ, отриманих в результаті гідролізу крохмалю, містять від 15 до 75% глюкози.
ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ Журавський Г.І. Глибинний спосіб виробництва лимонної кислоти. - Мікробіологія, 1955, т.XXIV. вип.3, с.332-340.
Патент 202709 ЧССР, кл. C 12 P 7/48. Zpusob vyroby kyseliny citronove submersnum zpusobem zkvasovanum cukernych roztoku pliseni Asp. niger. - Zerpold S. (ЧССР), Musilkova M. (ЧССР), Fencil Z. (ЧССР), Ujcova E. (ЧССР), опубл. 30.05.80.
Штам гриба Asp. niger ВКПМF-501 продуцент лимонної кислоти. - В.М.Голубцова (СРСР); В.П.Ермакова (СРСР); Е.С.Мінц (СРСР); Т.А.Нікіфорова (СРСР); А.В.Галкін (СРСР); В.М.Фінько (СРСР); В.Н.Жданова (СРСР).
Білай В.І. Коваль Е.З. The genus Asperilli -Київ. Наукова думка, 1988.
Штам гриба Aspergillus niger ВКПМ F-681 продуцент лимонної кислоти.