Використання: біотехнологія, харчова і медична промисловість. Суть винаходу: в розріджену білкову фракцію яйця додають 0,6 1,4% -ний розчин аміаку. Виділення лізоциму проводять шляхом сорбції, здійснюваної послідовним пропусканням через сорбент сілохром марки СХ-ЗВ, попередньо врівноважений стартовим розчинником, в якості якого використовують 0,6-1,4% -ний розчин аміаку. розчин білка і знову стартового розчинника з наступною елюції лізоциму сумішшю 0.8-2,0% -ного розчину оцтової кислоти з 0,1-0,3 М хлористого натрію, після чого розчин лізоциму піддають концентрування на порожніх волокнах. 70 L,
(5!) 5 З 12 N 9/36. А 23 J 1/08
Комітет Російської Федерації по патентах і товаріимзнакам (21) 5000076/13 (22) 01.08.91 (46) 15,02.93. Бюл. N. 6 (71) Центральний інститут удосконалення лікарів (72) В.Н.Морозов, С.А.Самарін. Е.Г.Щербакова, Т.П.Журавлева, С.С.Жуков, В.П.Чупрунов і А, В.Кучмій (73) Центральний інститут удосконалення лікарів (56) Патент Франції М 256972, кл. З 12 N
9/36, опублік. Тисяча дев'ятсот вісімдесят п'ять.
М 7123438, кл. З 12 N 9/36, 1977, (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ лізоциму
Винахід відноситься до біотехнології, харчової та медичної промисловості. зокрема до технології отримання лізоциму з білка курячих яєць. Лізоцим використовується як лікарський препарат в якості харчової добавки і в молочній промисловості для збагачення захисними факторами продуктів дитячого та лікувального харчування.
Метою винаходу є спрощення технологічного процесу.
"СХ-ЗВ", попередньо врівноважений стартовим розчинником, в якості якого використовують 0,6-1,4 Д-ний розчин аміаку, розчин білка і знову стартового розчинника з наступною зл юціей лізоциму сумішшю 0,8-2,07ь-ного розчину оцтової кислоти з 0,1-0,3 М хлористого натрію, після чого розчин лізоциму піддають концентрування на порожніх волокнах. подальшої злюціей лізоциму сумішшю
0,8-2,0% -ного розчину оцтової кислоти з
0,1-0,3 М хлористого натрію, після чого розчин лізоциму піддають концентрування і діафільтрація на порожніх волокнах.
Вперше для виділення лізоциму в якості сорбенту використовується макропористий силікагель сілохром марки "CX-ЗВ"
ГОСТ 10973 або ТУ 38,101832-80, який є слабким катіонообменнік на основі бурсілікатного скла. Сілохром "CX3B" володіє високою проникністю, що не ущільнюється, не деформується, не схильний до біодеструкції, вирішено питання з його хімічною стерилізацією, Ь даний час є вітчизняний виробник випускає сорбент в необхідних кількостях, В пропонованому техніческо.л вирішенні відпрацьовані умови сорбції лізоцим; а на сорбенті з використаний .ем 0,6-1.4;!, - ного
Білок курячих яєць розріджують за допомогою проточного гомогенізатора і змішують з 0,6-1,4 -ним розчином аміаку в співвідношенні 1: 5. Попадання жовтка в білок неприпустимо навіть в малих кількостях, так як це призводить до псування сорбенту і зниження активності лізоциму. Отриманий розчин білка профільтровивают через грубі фільтри (або марлю. Складену в декілька шарів).
Для виділення лізоциму використовують хроматографическую колонку промислового зразка; діаметр 150 мм, висота 720 мм, місткість 12,8 літрів. Для подачі в колонку розчинів використовують перистальтический насос НШР-15 М, Стеження за виходом білкової фракції проводять за допомогою ультрафіолетового проточного детектора "Volcord $ ll" виробництва фірми LKB (Швеція), налаштованого на довжину проходить світла 280 нм. Колонку, заповнену сорбентом сілохром "СХ-3В", врівноважують стартовим розчинником. в якості якого використовують 0,6-1,4 -ний розчин аміаку. Потім отриманий розчин білка закачують насосом в, колонку.
Після садки на сорбент проводять промивання цим же стартовим розчинником до повного виходу з піку несорбіровавшіхся білків ( "проскакування"). Для елюції лізоцим з сорбенту через колонку суміш 0,8-2.0 -ного
55 розчину оцтової кислоти з 0,1-0.3 М хлористого натрію до повного елюювання лізоциму. Фракції елюата, що містять лізоцим, збирають, діафільтруют і одночасно концентрують на половолоконной ультрафільтраційний установці
УПВ-6, стерильно розфасовують у флакони і висушують ліофільно. Весь цикл отримання лізоциму триває 3-4 діб, при цьому хроматографія займає 10-14 год.
Приклад 1. Білок 1000 курячих яєць (30 л) розріджують за допомогою проточного гомогеніеатора і змішують з 0,6 -ним розчином аміаку в співвідношенні 1: 5. Отриманий розчин білка профільтровивают через грубі фільтри (або марлю, складену в декілька шарів). Для виділення лізоциму використовують хроматографическую колонку промислового зразка: діаметр
150 мм, висота 720 мм, місткість 12,8 літрів. Для подачі в колонку розчинів використовують перистальтический насос НШР-15
М1 Стеження за виходом білкової фракції виробляють за допомогою ультрафіолетового проточного детектора "Volcord Sll" виробництва фірми LKB (Швеція). налаштованого на довжину проходить світла 280 нм. Колонку заповнюють сорбентом сілохром "СХ-ЗВ" і врівноважують стартовим розчинником, в якості якого використовують 0 6 -ий розчин аміаку. Отриманий розчин білка закачують насосом в колонку. Після ліеоціма на сорбенті проводять промивання стартовим розчинником до повного виходу з колонки несорбіровавшіхся білків ( "проскакування"). Для елюції лізоциму через колонку прокачують 0,8 -ний розчин оцтової кислоти з 0,1 М хлористого натрію до повного елюювання лізоциму.
Фракції, елюата, що містять лізоцим, збирають, діафільтруют і одночасно концентрують на половолоконной ультрафільтраційний установці УПВ-6, стерильно розфасовують у влакони і висушують ліофільно. Гомогенність отриманого продукту підтверджують методом електрофорезу в градієнтному поліакриламідному гелі. Активність лізоциму 9601060 ЕДlмг, що відповідає ТУ
Техред М.Моргентал Коректор С.Лісіна
НВО "Пошук Роспатенту
113035, Москва, Ж-35, Раушской наб. 4/5
Виробничо-видавничий комбінат "Патент, м Ужгород, вул.Гагаріна, 101 твор білка профільтровивают стартовим розчинником в якості якого використовують 1,4 -ний розчин аміаку, колонку з сорбентом сілохром" СХ-ЗВ "закачують отриманий розчин білка. Потім проводять промивання цим же стартовим розчинником до повного виходу з колонки несорбіровавшіхся білків ( "проскакування"). Злюцію ліеоціма з сорбенту проводять сумішшю 2 (, ного розчину оцтової кислоти з 0,3 М хлористого натрію, Зібраний елюат лізоциму концентрують і обессолівают на підлог олоконной ультрафільтраційний установці. розфасовують і висушують ліофільно. Вихід лізоциму склав 65,3 м Продукт гомогенен при визначенні електрофорееом в поліакриламідному гелі.
Активність ліеоціма тисячі Едlмг, що відповідає ТУ 64-3-208-85 на лізоцим-лороСпособ отримання лізоциму, що включає розрідження білкової фракції яйця, обробку лужним розчином і виділення лізоциму ІЕ отриманого розчину. про тл і ч а ю шийся тим, що, з метою спрощення технологічного процесу, як лужного розчину використовують 0,6-1,4 ний розчин аміаку, а виділення проводять шляхом сорбції, здійснюваної. шок. Цикл отримання зайняв 4 доби, при цьому хроматографія †"14 ч.
Таким чином, пропонований спосіб має наступні переваги:
5 1. Дозволяє спростити технологічний процес: скоротити час виділення цільового продукту з 12 до 3-4 діб, виключити многостадийность, 10 встановити необхідність використання великих ємностей, дозволяє проводити виділення лізоциму без охолодження.
2 »Використовувати для виділення целево15 го продукту вітчизняний дешевий сорбент, 3. Скоротити робочі площі.
4. Дозволяє розумний ь шити сольовий соста в стічних вод.
20 послідовним пропусканням через сілохром СХ-ЗВ, попередньо врівноважений стартовим растврорітелем, в якості якого використовують 0,6-1,4 -ний розчин аміаку, розчину білка і знову стартовго розчинника з наступною елюції лізоциму сумішшю 0,8-2,0-ного розчину оцтової кислоти з 0,1-0,3 M хлористого натрію, після чого розчин ліеоціма піддають концентрування і діафільтрація на порожніх волокнах.