Для роботи необхідно мати чисті і знежирені предметні і покривні скла. Нові скла кип'ятять 15-20 хв в 2-5% розчині соди або мильній воді, споліскують водою і поміщають в слабку хлороводневу кислоту, потім ретельно промивають водою.
Скло, що були у вжитку і забруднені барвниками або іммерсійним маслом, можна обробити двома способами: 1) занурити на 2 ч в концентровану сірчану кислоту або хромовую суміш, а потім ретельно промити; 2) кип'ятити 30-40 хв в 5% розчині соди або лугу. Необроблені скла можна знежирити, натер їх милом, а потім очистити від нього сухою тканиною.
Увага! Якщо скло добре знежирене, то крапля води розтікається на ньому рівномірно, не розпадаючись на дрібні краплі.
Зберігають скла в судинах з притертими пробками в суміші Никифорова (рівні обсяги спирту і ефіру) або в 96% спирті. З розчинів скла витягають пінцетом.
Увага! При роботі скла тримають пальцями за межі.
Матеріал для дослідження наносять на предметне скло бактеріальної петлею, голкою або пастерівської піпеткою. Найчастіше застосовують бактеріальну петлю (рис. 7), зроблену з платинової або нихромовой нитки довжиною 5-6 см. Петлю закріплюють в Петледержателі або впаивают в скляну паличку. Кінець дроту згинають у вигляді кільця розміром 1 × 1,5 або 2 × 3 мкм.
Мал. 7. Голка і петлі для посіву. 1 - голка; бактеріальні петлі: 2, 3 - петлі приготовлені неправильно; 4 - петля приготовлена правильно
Увага! Правильно приготовлена петля при зануренні у воду і витяганні звідти зберігає водну плівку.
Перед приготуванням мазка робочу частину петлі пропалюють в полум'я пальника у вертикальному положенні: спочатку саму петлю, а потім металевий стрижень. Цю маніпуляцію проводять і після закінчення посіву.
Приготування мазка з культури, вирощеної на рідкому поживному середовищі. Знежирене предметне скло пропалюють в полум'я пальника і охолоджують. На предметне скло, поміщене на підставку (чашку Петрі, штатив), наносять культуру. Пробірку з культурою тримають великим і вказівним пальцями лівої руки. Петлю тримають в правій руці. Не випускаючи петлі, мізинцем правої руки притискають пробку до долоні і обережно виймають її з пробірки. Рухи повинні бути плавними і спокійними. Горло пробірки обпалюють у полум'ї пальника. Вводять петлю в пробірку. Охолоджують петлю об стінку пробірки і потім занурюють її в культуру. Виймають петлю, не торкаючись нею стінок пробірки. Закривають пробку, попередньо провівши її через полум'я пальника. Ставлять пробірку в штатив. Петлею наносять культуру на предметне скло, круговими рухами рівномірно розподіляючи її. Потім петлю пропалюють в полум'я пальника. Мазок залишають для висихання.
Увага! Мазок повинен бути рівномірно розтертим, тонким і невеликим (з двокопієчну монету).
Приготування мазка з культури, вирощеної на щільному живильному середовищі. На підготовлене предметне скло наносять пастерівською піпеткою або петлею краплю ізотонічного розчину натрію хлориду (0,9%). Культуру обережно знімають петлею з агару в пробірці або чашці Петрі і емульгують у краплі на склі. Приготований мазок повинен бути рівномірним і не густим. При його висиханні на предметному склі залишається слабкий наліт.
Приготування мазка з гною або мокротиння. Матеріал забирають стерильною піпеткою або петлею і наносять на середину предметного скла. Другим предметним склом вкривається першим так, щоб вільними залишилися третину першого і другого стекол. Скло з зусиллям розсовують в сторони. Отримують два великих мазка.
Приготування мазка з крові. Краплю крові наносять на предметне скло на відстані однієї третини від лівого краю. Потім краєм спеціально відшліфованого скла, нахиливши його під кутом 45 °, торкаються до краплі крові. Притискаючи відшліфоване скло до предметного просувають його вперед. Правильно приготовлений мазок має жовтуватий колір і просвічує.
Приготування мазків-відбитків з внутрішніх органів трупів і харчових продуктів твердої консистенції. Поверхня органу або харчового продукту припікають розпеченим скальпелем і з цієї ділянки вирізають шматочок матеріалу. Пінцетом обережно захоплюють цей шматочок і поверхнею зрізу торкаються до предметного скла в двох - трьох місцях, роблячи ряд мазків-відбитків.
Мазок висушують на повітрі при кімнатній температурі. У разі необхідності його можна висушити близько полум'я пальника, тримаючи скло в горизонтальному положенні за краї великим і вказівним пальцями мазком догори.
Увага! При високій температурі може статися порушення структури клітин.
Мазки фіксують після повного висихання з метою: 1) закріпити мікроорганізми на склі; 2) знешкодити матеріал; 3) убиті мікроорганізми краще сприймають забарвлення. Фіксований мазок називається препаратом.
Способи фіксації. 1. Фізичний - в полум'ї пальника: скло беруть пінцетом або великим і вказівним пальцями і триразово проводять через верхню частину полум'я пальника протягом 6 с.
2. Хімічний - в рідини: клітинні елементи в мазках з крові і мазках-відбитках при дії високих температур руйнуються, тому їх обробляють однією з фіксуючих рідин: а) метиловим спіртом- 5 хв; б) етиловим спиртом - 10 хв; в) сумішшю Никифорова - 10-15 хв; г) ацетоном - 5 хв; д) парами кислоти і формаліну - кілька секунд.
Після фіксації приступають до фарбування препарату.
Забарвлення препаратів виробляють на спеціально обладнаному столі, вкритому лінолеумом, пластиком, склом і т. Д. На столі необхідні посудину з дистильованою водою; підставка з двох трубочок або паличок, з'єднаних гумовими трубками з обох сторін (для розміщення препаратів); пінцети, циліндри, піпетки, фільтрувальний папір, набір барвників, ємність для їх зливу. Стіл для забарвлення повинен перебувати поруч з водопровідних краном.
Ставлення мікроорганізмів до барвників називається їх тинкторіальних властивостями. У мікробіології широко використовують анілінові барвники. Більшість мікроорганізмів краще сприймає основні барвники.
Найбільш споживані наступні барвники: червоні (фуксин основний, фуксин кислий, конго червоний, нейтральний червоний); сині (метиленовий і толуїдиновий); фіолетові (генціановий, метиловий, кристалічний); коричнево-жовті (везувін, хрізоідін); зелені (діамантовий, малахітовий).
Всі барвники випускають у вигляді аморфних або кристалічних порошків. З них готують насичені спиртові і фенольні розчини, а потім для роботи використовують водно-спиртові або водно-фенольні розчини барвників. Якщо при фарбуванні використовують концентровані розчини барвників, то препарат попередньо накривають фільтрувальним папером, на яку наносять барвник. При цьому шматочки барвника залишаються на папері.
Увага! Краплю барвника наносять піпеткою так, щоб він покрив весь препарат.
1. Насичені спиртові розчини (вихідні):
барвника - 1 г спирту 96% - 10 мл
Суміш поміщають в термостат до повного розчинення на кілька днів. Збовтують щодня. Зберігають в склянках з притертими пробками.
2. Карболовий фуксин Ціля (для забарвлення кислотостійких мікроорганізмів, спор і капсул):
насиченого спиртового розчину основного фуксину - 10 мл розчину карболової кислоти 5% - 90 мл
Увага! Карболову кислоту вливають в барвник, а не навпаки.
Суміш протягом декількох хвилин енергійно струшують, фільтрують і зливають у флакон для зберігання.
3. Фуксин Пфейффера (для забарвлення по Граму і для простого методу забарвлення):
Фуксину Циля - 1 мл води дистильованої - 9 мл
Барвник готують безпосередньо перед застосуванням.
4. Карболовий генціановий фіолетовий (для забарвлення по Граму):
насиченого спиртового розчину
генціановий фіолетового - 10 мл
карболової кислоти 5% - 100 мл
Розчини змішують і фільтрують через паперовий фільтр.
5. Розчин Люголя (для забарвлення по Граму і реактив на крохмаль):
йодиду калію - 2 г кристалічного йоду - 1 г дистильованої води - 10 мл
Суміш поміщають в бутель матового скла, добре закупорюють і ставлять на добу в термостат, потім додають 300 мл дистильованої води.
6. Лужний розчин метиленового синього Леффлера:
насиченого спиртового розчину метиленового синього - 30 мл розчину гідроксиду калію 1% - 1 мл дистильованої води - 100 мл
7. Папірці по Синяву (для забарвлення по Граму):
1% спиртовий розчин кристалічного фіолетового
Смужки фільтрувального паперу просочують розчином і висушують.
Методи забарвлення ділять на орієнтовні (прості) і диференціальні (складні), що виявляють хімічні і структурні особливості бактеріальної клітини.