Хімічно компетентні клітини можна трансформувати неочищеної лігазну сумішшю (і взагалі DNA, що знаходиться в помірно сольовому буфері). Кількість клітин в хімічно-компетентної фасування значно менше ніж в електрокомпетентной, тому можна висівати всю фасовку на одну чашку.
Приготування компетентних клітин.
зі стоку (-70 o С) розсіяти бактерії штрихом на чашку з селективної середовищем;
вирощувати 37 o С, ON;
кілька колоній (10-12) діаметром
2-3mm помістити в 40ml SOB в колбі 0.5-1.0L.
інтенсивно струшувати (200-300rpm)
* Або при 37 o С - компетентність середнього рівня, але час зростання невелике,
* Або при 18 o С (переставити гойдалку в холодну кімнату) - компетентність вище, але час зростання - кілька діб;
всі подальші маніпуляції проводити на холоду.
в 50ml ЦФ-пробірку помістити 30ml культури;
0 o C, 10-15 ';
ЦФ 2-3krpm 4 o C, 10 ', злити супернатант;
ЦФ 2-3krpm 4 o C, 20 '', ретельно видалити залишки рідини;
суспендованих в 10ml TB;
0 o С, 10-15 ';
повторити п.7, 8;
ресуспензіровалі в 2ml TB;
+ DMSO до 3.5% (70μl);
0 o С, 10-15 ';
повторити п.14,15;
разаліквотіть по 100μl в охолоджені 2ml пробірки з кришками;
заморозити в рідкому азоті;
зберігати в рідкому азоті (краще) або на -70 o С.
приготувати з 100х стоку (0.5μg / ml) свіжий розчин pDNA 5ng / ml;
відтанути в льоду 0.5M bMeEtOH і аліквоту клітин;
до аліквоти компетентних клітин додати:
4μl 0.5M bMeEtOH,
2μl (10pg) pDNA;
0 o C, 20-60 ';
42 o C, 30 '', без струшування;
відразу в лід, 2 ';
+ 400μl SOC;
щільно загвинтити кришку, струшувати горизонтально на бактеріальному шейкері 37 o С, 30 ';
висіяти 50μl на чашку з антибіотиком;
якщо виросло "N" колоній, то компетентність = Nх10 6 [колоній / μg].
- аналогічно "контрольної";
- на одну аліквоту можна брати pDNA в обсязі o С (титр при цьому не змінюється). На наступний день розрахувати кількість клітин на висів, висіяти.
10%.Частота трансформації постійна до
10ng pDNA / 100μl клітин, далі досить швидко падає.
Насичення в районі 100-200ng / 100μl клітин.
> 25ng / 100μl клітин - з помітною частотою з'являються подвійні трансформанти.
У разі великої кількості простих трансформацій (наприклад, клонування плазмід) роботу можна значно прискорити, якщо (i) брати для трансформації маленький обсяг клітин (
20μl), (ii) висівати штрихом відразу після теплового шоку (без "пожвавлення").
Ми читали і чули зовсім різні думки про вимоги, що пред'являються до якості DMSO. Тому про всяк випадок користуємося "Sigma, # D2650", розфасованим під аргоном (аліквоти в ампулах по 5 або 10ml). Фасуємо його один раз і зберігаємо фасування при -70 o С.
Основні переваги хімічно компетентних клітин перед електрокомпетентнимі:
- Хімічно компетентні клітини можна трансформувати неочищеної лігазну сумішшю (і взагалі DNA, що знаходиться в помірно сольовому буфері). У разі електрокомпетентних - DNA повинна бути очищена, тому що (I) занадто висока концентрація солі здатна викликати іскровий розряд в осередку (ii) при електротрансформаціі в оболонці E. coli з'являються дірки, в них може проникнути фермент, який використовується для лігування.
- Кількість клітин в електрокомпетентной фасування значно більше, ніж в хімічно-компетентних, тому не варто намагатися висівати на одну чашку занадто велику частку фасування. Це загрожує подростом (появою сателітних колоній) і зниженням компетентності.
Зростання при 37 o С призводить до різкої (з гострим максимумом) залежно компетентності від щільності клітин (A600 = 0.45 для DH10B). При 18 o С висока компетентність досягається в широкому інтервалі A600 = 0.35-0.70.
Зв'язок концентрації клітин з оптичною щільністю: OD550 = c [cells / ml] * 10 8 / k.
PIPES в складі TB можна замінити на HEPES або BES. Це призведе лише до невеликого зменшення компетентності. Ефективність трансформації практично постійна в діапазоні pH 5.6-7.0, однак при pH> 7.0 MnCl2 випадає в осад.
DMSO токсичний для бактерій у високій концентрації (це дозволяє не піклується про його стерильності), тому він додається до клітин в два етапи. Причому, краще додавати так, щоб не виникало зон "високої концентрації" (але занурювати кінець типчика в суспензію клітин можна - DMSO замерзне і закупорити тип). Або по краплях при постійному перемішуванні, або нанести на стінки охолодженої пробірки (де DMSO замерзне), з яких змити, помішуючи пробірку.
Пробірка повинна бути пластикової, застосування скляної колби може знизити ефективність приблизно в 10 разів (по видимому, через адсорбції DNA на скло).
Заморожування в рідкому азоті (холодової шок) підвищує компетентність в 4-5 разів.
Вплив розміру плазміди на ефективність трансформації: молярна частота практично постійна для розмірів
Тепловий шок: температура може бути в інтервалі 40-50 o С.
Є повідомлення, що якщо тепловий шок замінити "заморожуванням в рідкому азоті (1 '), оттаиванием (до NT)", то компетентність підвищиться в
Схожі статті