Виділення чистих культур фітопатогенних бактерій з однієї клітини має дуже важливе значення при вивченні освіти колоній, процесів розмноження, мінливість і спадковість, впливу на збудників бактеріозів рослин різних дезінфікуючих речовин, антибіотиків і ін. В літературі запропоновано вже багато методів ізолювання одиничних клітин. Тут ми наведемо опис лише деяких з них.
Фракційний метод Пастера
Метод цей в даний час застосовується дуже рідко і має велике історичне значення. Полягає він в наступному.
Невелика кількість досліджуваного матеріалу вносять в ряд пробірок із стерильним бульйоном або інший рідким живильним середовищем з таким розрахунком, щоб в останній пробірці приблизно залишилася одна клітина, при розмноженні якої буде отримано чистий культура. Здійснюється це таким чином: краплю досліджуваного матеріалу, що містить умовно 1000000 бактеріальних клітин, вносять в пробірку з 10 мл середовища і ретельно перемішують. Потім з цієї пробірки 1 мл переносять в іншу (також в 10 мл середовища) і знову ретельно струшують. Цю процедуру послідовно повторюють ще п'ять-шість разів. В останній пробірці отримують одну бактеріальну клітину, з якої потім розвивається чиста культура.
Метод розведення з подальшим висівом на тверду живильне середовище
З 1 мл суспензії бактерій, що містить 30000000 мікробних тіл (по фотометричному методу), при дотриманні правил стерильності виробляють десятикратні розведення до 10в-8.
Таким чином, в передостанній пробірці (розведення 10в-7) має перебувати близько трьох мікробних клітин. Потім по 1 мл кожного з трьох останніх розведень переносять і рівномірно розподіляють шпателем на підсушених чашках Петрі з картопляним агаром або іншої твердої живильним середовищем. Чашки поміщають в термостат на добу, потім зберігають при кімнатній температурі. На третю добу в чашках виростають поодинокі колонії. При використанні зазначеної методики можна припустити, що кожна колонія зросла з однієї клітини.
Крім поверхневого розсіву розведеного вихідного матеріалу застосовують метод розсівання в глибині щільного поживного середовища по Р. Коху. Метод має суттєві недоліки - колонії в товщі середовища повільно ростуть, морфологічні ознаки їх не характерні, витяг таких колоній важко. Тому необхідно застосовувати методи, що створюють умови для виділення чистої культури з свідомо однієї бактеріальної клітини. Робиться це під контролем мікроскопа з використанням пристосувань для мікроманіпуляцій.
метод мікроколоній
У порівнянні з методом рассевов бактеріальної суспензії метод мікроколоній має ту перевагу, що при його застосуванні проводиться пряме виділення культури з однієї клітини.
Суть методу полягає в тому, що з мікробних клітин, що підлягають розведення, готується сильно розбавлена суспензія в 0,5% -ному агарі або желатині, яка тонким шаром наноситься на поверхню стерильного скла. Скло закріплюють над вологою камерою у вигляді предметного скла з вишліфованнимі заглибленнями або скляного кільця.
Препарат із зазначеними під контролем мікроскопа окремими клітинами поміщають в термостат до утворення колоній. Потім за допомогою петлі або піпетки колонії переносять в окремі пробірки.
Метод мікроколоній дає можливість використовувати великі збільшення мікроскопа і порівняно надійно захищати мікроколонії від висихання і забруднення ззовні.
Технічно метод доступний і надійний, тому що виробляється перенос в поживні середовища виросли з окремих клітин колоній і виключається грубий і ненадійний перенесення від руки окремих дрібних клітин.
Метод агарових блоків Ерскова
Мікробну суспензію наносять на шар aгapa товщиною 2 3 мм, поміщеного на стерильне скло, потім окремі квадратики агару переносять на стерильні перехресно розкреслені покривні скла, які з поверхні закривають стерильним покривним склом. Під мікроскопом, застосовуючи суху або іммерсійну систему і матове освітлення, відзначають ті квадратики агару, які містять одну клітку. Скло поміщають в термостат. Шматочки агару разом з виросли в них колоніями за допомогою платинової голки переносять в живильне середовище.
Основний недолік методу - можливість забруднення з навколишнього повітря.
Метод Хорта із застосуванням перфорованих пластинок
На стерильну поверхню предметного скла наливають тонкий шар агару, на який після застигання наносять сильно розведену бактеріальну суспензію. На агар накладають тонку целулоїдну перфорированая пластинку і зверху накривають стерильним покривним склом. Під мікроскопом відзначають осередки, що містять по одній клітці. Колонії, що виросли в таких осередках, переносять «гарпуном» в живильне середовище.
Метод «ртутного щита» Топл, Бернарда і Вілсона
Цей метод полягає в наступному: незначна кількість шестигодинний культури досліджуваних бактерій вносять в 10% -ву желатину на пептонній воді і витримують при 37 ° С протягом 2 год. Маленьку краплю желатин петлею наносять на стерильне предметне скло і накривають стерильним покривним склом з кварцу або селініта. Рідина повинна розподілятися тонким шаром і зовсім не містити бульбашок повітря. Під мікроскопом знаходять одиничну клітку. На кварцове скло над кліткою за допомогою тонкої залізної зволікання наносять крапельку ртуті. Потім препарат опромінюють ультрафіолетовим світлом кварцової лампи (протягом 1 хв на відстані 7,5 см від лампи). В результаті все бактерії, крім захищеної ртуттю, гинуть. Через добу з уцілілої клітини розвивається колонія, яку пересівають в рідку середу.