Культури клітин придатні для виділення більшості вірусів тварин.
Для цієї мети використовують як первинно-трипсінізірована, так і перещеплюваних і диплоїдні культури клітин.
Зараження культур клітин проводять наступним чином. З пробірок або матраців з виросли монослоем клітин видаляють ростовую живильне середовище, відмивають моношар клітин від ростової середовища (в ній можуть бути антитіла до досліджуваного вірусу і неспецифічні інгібітори) розчином Хенкса і вносять віруссодержащего матеріал. Після контакту (1-1,5 год), необхідного для адсорбції вірусу на клітинах, віруссодержащего матеріал видаляють і вносять підтримуючу живильне середовище, яка не сприяє розмноженню клітин, але забезпечує їх життєдіяльність. Пробірки та матраци поміщають в термостат для інкубації. Адсорбувати на клітинах вірусні частинки проникають в клітини, репродукується в них і виходять в культуральну рідину, заражають нові клітини, потім наступні і так до тих пір, поки не залишиться живих клітин.
Виявити вірус в клітинах можна наступними методами (або ознаками):
1) по цитопатичної дії (ЦПД) або цитопатичної ефекту (ЦПЕ). ЦПД - це будь-які зміни клітин під впливом розмножується в них вірусу. Для виявлення ЦПД заражені культури клітин переглядають під малим збільшенням світлового мікроскопа. Форми ЦПД можуть бути дуже різними, що залежить від біологічних властивостей вірусу, виду клітин, дози зараження, умов культивування і т. Д. Одні віруси виявляють ЦПД через 2-3 доби після зараження (ентеровіруси), інші - 1-2 тижні (аденовіруси ). Найбільш істотно розрізняються між собою три форми ЦПД: фрагментація, округлення клітин, сімпластобразованіе.
Фрагментація - руйнування клітин на окремі фрагменти (вірус везикулярного стоматиту та ін.).
Округлення - клітини приймають кулясту форму і відокремлюються від скла (адено-, пікорнавіруси і ін.).
Сімпластобразованіе - освіту гігантських клітин: цитоплазма сусідніх клітин зливається внаслідок розчинення клітинних оболонок і утворюється одна велика клітина з багатьма ядрами (вірус ПГ-3, чуми великої рогатої худоби та ін.);
2) з її допомогою в культурі клітин можна виявити деякі віруси, які мають гемагглютінірующімі властивостями: віруси ПГ-3, грипу та ін. Реакцією гемадсорбції. Гемадсорбції називається прилипання (адсорбція) еритроцитів крові на поверхні клітин, заражених вірусом. Цей метод широко використовується при діагностиці ПГ-3 великої рогатої худоби, при цьому використовують еритроцити морської свинки;
3) методом освіти «бляшок». Цей метод технічно складніше інших і застосовується головним чином для титрування і клонування вірусів;
4) виявлення вірусу в РІФ. У тому випадку, якщо розмноження вірусів в культурі клітин не супроводжується цитопатическим ефектом, гемадсорбції, його присутність можна виявити за допомогою флуоресціюючих антитіл. Цей метод широко використовують при діагностиці класичної чуми свиней, ПАРВОВІРУСНИЙ інфекцій, сказу та ін .;
5) імунопероксидазному реакцією;
6) шляхом виявлення внутрішньоклітинних включень. Для виявлення тілець-включень культуру клітин вирощують на покривних стеклах, поміщених в пробірки, заражають піддослідним матеріалом і через певний час інкубації (при 37 ° С), скла промивають, фіксують і забарвлюють різними методами (гематоксилін-еозином, акридиновим помаранчевим і ін.) .
Розмножуються в культурах клітин віруси частково або повністю (в залежності від ступеня руйнування клітин) виходять в культуральну рідину, яка і використовується як готова суспензія вірусу. Якщо не всі клітини культури зруйнувалися в результаті розмноження в них вірусу, то їх руйнують шляхом 2-3-кратного заморожування і відтавання або ультразвуком.
Поділіться посиланням з друзями