Нагальною проблемою нашого часу є висока токсичність і низька ефективність хіміопрепаратів, які використовуються в лікуванні онкологічних захворювань. Будь-яка пухлина кожного конкретного пацієнта індивідуальна за рахунок особливої мікрогетерогенності клітин, визначеного набору молекулярно-генетичних маркерів, власного спектру продукуються біологічних речовин і складу рецепторів. У зв'язку з цим оптимальним методом для вирішення питання про вибір хіміопрепарата для конкретного хворого був би підбір ліки, вибірково переважної invitro зростання пухлинної культури, приготовленої на основі клітин його пухлини. Такий підхід стає можливим завдяки застосуванню сучасних клітинних технологій вирощування культури злоякісної тканини поза організмом. Так само, як бактеріологічне дослідження є золотим стандартом для постановки діагнозу інфекційного захворювання, дослідження invitro чутливості на лікарську терапію пухлинних клітин, взятих з організму, вже найближчим часом може стати одним зі стандартів обстеження хворих з онкологічними захворюваннями.
Найбільш ефективною і максимально наближеною за властивостями і організації до природної пухлини системою, що використовується в даний час при скринінгу потенційних протипухлинних препаратів [1], може бути система 3D-культури, представлена сферичними конгломератами. Вперше вирощування подібних культур клітин документально відзначено в 1944 р Іоганесом Холтфретером [2], які працювали зі сферичними агрегатами ембріональних клітин, які імітували щільні тканини, безсудинні пухлини, тіла ембріонів.
Клітинний ріст монослойной культури, вже широко використовується в доклінічних випробуваннях, за багатьма параметрами не відображає справжньої картини зростання пухлини в живому організмі, де величезне значення в її прогресії мають взаємодії не тільки між клітинами самої пухлини, а й з навколишнім її екстраклеточной матриксом, представленим в своїй основі клітинами сполучної тканини і колагеновими волокнами. Особливості росту окремих клітин пухлини в монослойной, 2D- і 3D-культурах впливають на характер реакції пухлинної культури в ході експериментального лікарського впливу. Відомо, що клітини пухлини в 3D-культурі більш стійкі до хіміотерапії, показують обмежену здатність до поглинання хіміопрепаратів, на відміну від клітин в 2D-культурі. Так, антиапоптотический білок Bcl-2 родини під дією протипухлинного агента - доцетаксела в монослойной культурі клітин раку легені виявляється в меншій кількості в порівнянні з 3D-культурою, що говорить про більш агресивному і лікарсько стійкому поведінці пухлинних клітин в тривимірних асоціаціях [3].
Різна чутливість до хіміотерапії клітинних культур, вирощених в 2 D- і 3D-режимах, виявлена і досліджена в багатьох роботах. Наприклад, в роботі VörsmannH. еtal. [4] при вивченні чутливості TRAIL-рецептора 2D-клітинних ліній меланоми до спрямованої хіміотерапії було виявлено, що при сублетальні опроміненні ультрафіолетом культури, будучи до цього резистентними до TRAIL-опосередкованої загибелі, стали чутливими через активацію каспаз-3-залежного розщеплення X-асоційованого білка, ингибирующего апоптоз. Подібні, але менш виражені результати були отримані при впливі цисплатину. Але в 3D-клітинній культурі меланоми цисплатин виявився більш ефективним активатором TRAIL-опосередкованого апоптозу, ніж ультрафіолет [4].
В даний час для створення екстраклеточной матриксу для 3D-культур пропонуються різні методичні підходи. Перший підхід пов'язаний із застосуванням компонентів природних тканин - колагену, базальних мембран, алгіната (речовини, одержуваного з водоростей), фібрину, хітозану, клітин сполучної тканини, в т.ч. кератиноцитів. Другий підхід пов'язаний з використанням синтетичних матеріалів - модифікованих форм гіалуронової кислоти, поліетиленгліколю, що самоорганізуються гидрогелей білків, полікапролактона і ін. Недоліками природних компонентів є: біологічне різноманіття, слабка механічна складова, ризик імунної відповіді або передачі патогенного фактора, неможливість жорсткого контролю і незалежної модифікації властивостей , що призводить до можливості діагностичних помилок і відсутності стандартизованих умов. Головним недоліком синтетичних матеріалів є низька биоактивность або її повна відсутність [1, 5].
Уже перші методики вирощування тривимірних культур пухлин переконливо обгрунтували характер росту 3D-культури пухлини invitro як invivo -подібний. Клітинні популяції в 3D-культурі зберігали свою гетерогенність, що не розрізняла отримані пухлини від розвиваються в природних умовах організму. Так був отриманий ріст в культурі 17 типів пухлин легені, різних відділів кишечника, кістки, шиї, нирки, простати, шлунка, щитовидної залози, яєчника і яєчка, шкіри, зразки яких були отримані интраоперационно. Зростання підтримувався в середовищі до 100 і більше доби. Тканини організму як макро- і мікрооточення розвивається пухлини в даному дослідженні замінювали колагеновим гелем. Диференціація в культурах пухлин підтверджувалася також тим, що при культивуванні клітин раку легені у вигляді суспензії одні утворювали конгломерати і центри зростання в підвішеному стані, інші - мігрували до пластикових стінок чашею і утворювали гнізда зростання пристеночно, що побічно може свідчити про більшу чи меншу їх злоякісності . Культури пухлин при зростанні в експериментальних умовах не втратили своєї злоякісності. Так, в роботі FreemanA.E. andHoffmanR.M. [6] при трансплантації 5 млн. Клітин меланоми, отриманої від хворого і культивованої потім в культурі протягом дев'яти місяців, трьом тімусектомірованним мишам, у кожної з них виросла пухлина розмірами до 1/3 і більше від розміру самої миші протягом 2,5 місяців. Тобто об'єктивно було показано збереження рис злоякісності в 3D-культурах клітин invitro. в коллагеновом гелі спостерігався інвазивний ріст клітин раку шлунка, а клітини меланоми продовжували продукувати меланін після припинення проліферації.
У створенні тривимірних тканин, в залежності від поставлених цілей і вибраного обладнання, може бути виділено п'ять основних напрямків: створення платформи з середовищем, що імітує микроокружение пухлини, без підкладки - для зростання пухлинної тканини у вигляді сфероидов; застосування підкладок, що створюють певне обмеження в зростанні; використання гелів, наприклад, полімерних гідрогелів при створенні умов для формування сфероидов пухлинних клітин в моделі «підвішених капель»; створення біореакторів для постійного контролю біохімічного складу середовища, в якій формується пухлинна культура, подачі поживних речовин і відведення продуктів розпаду, метаболітів; а також використання мікрочіпів [7]. 3D-підкладки забезпечують поверхню, щільну і пружну середу для росту клітин пухлини, тому до них пред'являється ряд особливих вимог: пористість, взаимоположение пір, геометрія пір, їх розмір і розподіл. Крім того, елементи мікрорівня опосередковують транспорт, дифузію поживних речовин і метаболітів і навіть здатні впливати на активність певних генів і поведінку клітин, їх проліферацію і диференціювання.
Конгломерати клітин (сфероїди) в 3D-культурі є подібністю безсудинних пухлинних вузлів, мікрометастазів або межкапіллярние ділянок солідних пухлин, як було показано в роботі HoltfreterJ. [2]. У роботі VörsmannH. еtal. [4] на початковому етапі вирощування клітин в 3D-культурі для формування сфероидов, наприклад злоякісної меланоми, отримували краплі середовища з суспензією клітин методом «підвішеної краплі» при співвідношенні 250 клітин в 25 мкл середовища RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium). Такі краплі поміщалися на протівоадгезіонную поверхню чашки Петрі з фосфатним буфером. Сфероїди инкубировались протягом 15 днів при 37 ° С і 5% -м вмісті СО2. Через кожні три доби проводилася зміна 8 мкл середовища кожної краплі. Потім, для підтвердження метастатичного характеру росту певних клітинних ліній меланоми, сфероїди конкретного числа і розміру, отримані в краплях, вносили в органоподобних еквіваленти шкіри, що складаються з кератиноцитів, фібробластів та колагену, де на 31 день культивування сфероїди досягали діаметру в 500 мкм. Отримані сфероїди клітин меланоми при визначенні терапевтичної ефективності лікарських засобів мали наступними особливостями: кількість і розмір гнізд зростання меланоми в культурі були непередбачувані; одержувані гнізда зростання клітин меланоми в культурі зазвичай менше, ніж метастази пухлини в організмі; в зв'язку з обмеженою тривалістю життя отриманих гнізд лікувальну дію починалося раніше, і негативний вплив впливу могло з часом накладатися на природні процеси регресії зростання пухлини [4].
При вивченні впливу лікарських засобів в 3D-культурі злоякісних клітин необхідно враховувати такі фактори, як розчинність, хімічну і метаболічну стабільність, зв'язування з білками і захоплення клітинами речовини з середовища для детального розуміння механізмів терапевтичної дії invitro. Також важливо розуміти і неоднорідність процесів дифузії і метаболізму клітин всередині пухлинного вузла: до центру буде наростати гіпоксія і нестача поживних субстратів, які проявляються градієнтом зниження мітотичної активності і некротичними змінами, що безпосередньо обмежує дифузію лікарської речовини всередині пухлини. В роботі JusticeB.A. etal. [3] були запропоновані моделі зростання культур пухлинних клітин з обмеженою дифузією: у вигляді колоній в колагенових гелях, як «гістокультури» і як клітинні мультишарів на 96-лунковому планшеті з V-подібним дном.
В роботі SzotC.S. etal. [8] були проведені порівняльні дослідження властивостей пухлинних клітин в різних клітинних культурах - монослое, 2D- і 3D-культурах на терапевтичну дію. Для порівняльної оцінки ефективності дії протипухлинного препарату доксорубіцину і наночастинок і ступеня їх поглинання окремими клітинами в монослое і мультіклеточнимі сфероїді розміром 100-300 мкм використовували клітинні лінії недрібноклітинного раку легені. Було встановлено, що для пригнічення росту сфероидов були потрібні в 60 і більше разів більші концентрації таких препаратів, як доцетаксел, цисплатин, гемцитабін, 5-фторурацил, камптотецин, ніж для клітин в монослое. Наприклад, при концентрації доцетаксела в межах 100-175 мкм загальне число сфероидов було на 50% менше, ніж в контролі. При виявленні клітин в стані апоптозу (за експресією активованої каспаз-3) зафіксовано їх меншу кількість в 3D-системі (в 2,09 і 2,47 рази для 5-фторурацилу і камптотецину, відповідно), ніж в монослойной культурі. При вивченні проникнення доцетаксела і наночастинок всередину клітин сфероидов встановлено, що всередині багатошарових конгломератів виявилося тільки 10,52% доцетаксела після двогодинної експозиції, а інфільтрірованіе наночастинками спостерігалося тільки по периферії сфероидов [8].
Техніка вирощування тривимірних клітинних культур постійно вдосконалюється. Так, система Alvetex® пропонує одноразово в одній живильному середовищі (буквально в одній лунці) вирощувати кілька культур (частіше дві), як багатошарових, так і моношарових, в різних поєднаннях за рахунок особливої конструкції застосовуваної посуду, що забезпечує оптимальний доступ поживних речовин із середовища до культурам [10].
В останні роки напрямок відтворення, вивчення і застосування живих тканин в тривимірному вимірюванні переходить на мікрорівень, в тому числі на мікрочіпи. Створені умови і передумови для вивчення біологічних структур, систем і людського організму invitro. Т.зв. «Орган на чіпі» являє собою микросистему, що об'єднує досягнення в сфері мікрожідкостних технологій і клітинного культивування з використанням структур мікрочіпа. При цьому використовуються микроколичества рідини (від 1/10 8 -1/10 6 л), які, проходячи по Мікроканали системи, дозволяють виявити градієнти розподілу конкретних речовин в певних шарах відтворюється тканини і навіть всередині самої тканини. Такі системи дозволяють відтворювати ключові структуру, функціональні, біохімічні та механічні особливості живих органів, таких як легке, печінка, нирка, кістка, мозок, око і ін. Формувати моделі патології і схеми терапевтичного впливу [11].
Наприклад, «легке-на-чіпі» виглядає як два полі-диметил-силоксанових (тобто з різновиду силіконової гуми) мікрожідкостних каналу, розділених тонкою (10 мкм) і гнучкою мембраною з тієї ж силіконової гуми з порами діаметром 10 мкм. У такій микросистеме відтворюються циклічні ефекти дихання. Легке-на-чіпі було використано в дослідженнях по нанотоксикології [12], в яких різні типи наночастинок вводилися через повітряні канали цієї мікросистеми. Проходячи через епітеліальний і ендотеліальний клітинні шари шляхом трансцитозу, силіконові наночастинки (12 нм) викликали цитотоксичность і запалення, і були безпосередньо виміряні в режимі реального часу в межах мікроканалу за допомогою мікрофлуоріметріі. У подібній микросистеме при проходженні пухлинних клітин через пори мембрани були створені умови для формування гетероклеточних сфероидов в 3D- мікрожідкостной культивованої системі, що відтворювало поведінку клітин метастатичного раку простати в мікрооточенні [13]. Подібна стратегія в іншому дослідженні дозволила встановити внутрисосудистую адгезію циркулюючих клітин раку грудей у відповідь на активацію ендотелію цитокіном CXCL12 [14].
Таким чином, робота з 3D-злоякісними культурами клітин веде до індивідуальної, спрямованої і максимально ефективної протипухлинної терапії з мінімізацією ризиків побічних ефектів і невиправданого тривалого, часто неефективного застосування хіміотерапії. Поки подібна специфіка дій в нашій країні залишається нерозвиненою. Більш активно по шляху створення 3D-тканин, а точніше, вирощування цілих органів, рухається тільки трансплантологія. В даний час російськими вченими на базі інноваційного центру «Сколково» ведеться розробка проекту щодо визначення генетичного профілю кожної пухлини, що обумовлює чутливість / стійкість конкретного злоякісного новоутворення конкретного хворого до певних протипухлинних препаратів, в результаті на основі даних генетики обґрунтовується вибір певної таргетной терапії. Однак це досить дорогий проект, що вимагає складного обладнання та створення спеціалізованих програм. У зв'язку з цим, розвиток «культурального» напряму персоналізованої хіміотерапії онкологічних хворих видається більш економічно вигідним і перспективним для практичного застосування в медицині.