Регуляція транскрипції (див. Лекцію № 6).
Суттєве значення в забезпеченні різноманітності білків відіграє посттранскрипційна процесинг РНК. Основні способи такої регуляції - альтернативний сплайсинг і зміна стабільності РНК.
Відомі й деякі випадки регуляції кількості і різноманітності білків шляхом зміни швидкості процесу їх трансляції. Найбільш вивчений приклад - синтез білків в ретикулоцитах. Відомо, що на цьому рівні диференціювання кровотворні клітини позбавлені ядра, а отже і ДНК. Регуляція синтезу білка-глобіну здійснюється тільки на рівні трансляції та залежить від змісту гема в клітці.
Інгібітори матричних биосинтезов
Існує велика група речовин, що пригнічують синтез ДНК, РНК або білків. Деякі з них знайшли застосування в медицині для лікування інфекційних хвороб та пухлинних захворювань, а інші є для людини найсильнішими токсинами. До останніх можна віднести токсин блідої поганки α-аманитин, який є інгібітором еукаріотичних РНК-полімерази.
Дія інгібіторів матричних биосинтезов як лікарських препаратів засноване на:
1. модифікації матриць (ДНК або РНК);
2. білоксинтезуючого апарату (рибосом);
3. інактивації ферментів.
Центральне місце серед них належить антибіотиків - різноманітним за хімічною будовою органічних сполук, що синтезуються мікроорганізмами. Короткі відомості про антибіотики, що пригнічують матричні синтези, наведені в таблиці 7.2.
Таблиця 7.2. Антибіотики - інгібіруюшіе матричні біосинтезу
Пригнічує ініціацію трансляціі.Связивается з 50S субодиницею рибосоми, викликає помилки в прочитанні інформації, закодованої в мРНК
Використання ДНК-технологій в медицині
Досягнення в галузі молекулярної біології істотно вплинули на сучасну медицину: вони не тільки поглибили знання про причини багатьох хвороб, але і сприяли розробці нових підходів у їх діагностики та лікування.
Для виявлення дефектів в структурі ДНК вона повинна бути виділена з біологічного матеріалу та "скопійована" (напрацьована) в кількостях, достатніх для дослідження. Для генно-терапевтичних робіт необхідно виділення нормальних генів і введення їх в дефектні клітини таким чином, щоб вони експресуватися, дозволяючи відновити здоров'я пацієнта.
Виділення ДНК включає швидкий лізис клітин, видалення фрагментів клітинних органел і мембран за допомогою центрифугування, руйнування білків протеазами, екстрагування ДНК з подальшим її осадженням. В ході виділення отримують дуже великі молекули, їх додатково фрагментують за допомогою рестриктаз. Утворені фрагменти поділяють методом електрофорезу. Кількість і довжина виходять фрагментів, і відповідно, розташування смуг на електрофореграмме унікально і специфічно для кожної людини.
Ідентифікація характерних послідовностей проводиться методом блот-гібридизації за Саузерну. Фрагменти ДНК піддають денатурації і здійснюють перенесення (блот) на щільний носій (фільтр або мембрану). Фіксовану на фільтрі ДНК гибрідизуючою з невеликими фрагментами ДНК або РНК, що містять радіоактивну (флюоресцентную або ін.) Мітку. Такі фрагменти називають ДНК-або РНК-зондами. Якщо в досліджуваному зразку є послідовності, комплементарні послідовностям зонда, то гібридизацію можна визначити візуально або за допомогою спеціальних приладів. Метод застосовується для діагностики інфекційних захворювань, спадкових дефектів, встановлення експресії тих чи інших генів.
Секвенування (визначення первинної структури) ДНК проводиться хімічним або ензиматичними методом. Метод Маскама і Гілберта (хімічний) заснований на хімічній деградації ДНК. Суть методу зводиться до наступного: один з кінців фрагмента ДНК мітять за допомогою радіоактивної або флюоресцентной мітки. Препарат міченої ДНК ділять на чотири порції і кожну з них обробляють реагентом, що руйнує одне або два з чотирьох підстав, причому умови реакції підбирають таким чином, щоб на кожну молекулу ДНК доводилося лише кілька пошкоджень. В результаті виходить набір мічених фрагментів, довжини яких визначаються відстанню від зруйнованого підстави до кінця молекули. Фрагменти, що утворилися в усіх чотирьох реакціях, піддають електрофорезу в чотирьох сусідніх доріжках; потім проводять їх ідентифікацію. Відповідно до положення відбитків можна визначити, на якій відстані від міченого кінця знаходилося зруйноване підставу, а знаючи це підстава - його положення. Так набір смуг визначає нуклеотидну послідовність ДНК.
Метод Сенгера (ферментативний) заснований на моделюванні ДНК-полімеразної реакції, де досліджувана молекула ДНК використовується в якості матриці. У реакційну суміш додають дідезоксінуклеотіди (ОН-група в 3'-положенні пентози відсутня). ДНК-полімераза включає ці попередники в ДНК. Однак, включившись в ДНК, модифікований нуклеотид не може утворити фосфодіефірную зв'язок з наступним дезоксірібонуклеотідов. В результаті елонгація даному колі зупиняється в тому місці, де в ДНК включився дідезоксірібонуклеотід. Реакція проводиться одночасно в чотирьох окремих пробірках, кожна з яких містить один з чотирьох дідезоксінуклеотідов і все 4 дезоксінуклеотідтріфосфата (до них, як правило приєднують радіоактивну або флюоресцентную мітку). У кожній з пробірок утворюється набір мічених фрагментів різної довжини. Довжина їх залежить від того, в якому місці в ланцюг включений дефектний нуклеотид. Отримані мічені фрагменти ДНК розділяють в поліакриламідному гелі з точністю до одного нуклеотиду, проводять ідентифікацію і по картині розподілу фрагментів в чотирьох пробах встановлюють нуклеотидную послідовність ДНК.