Загальні методи укладання препаратів
Парафінові зрізи, забарвлені жиророзчинними барвниками. Для виявлення деяких ліпідів, що не вимиваються з тканин при зневодненні, просвітління, заливці, депарафінірованіі і перенесення в воду, зрізи слід укладати в середовища, в яких жири та барвники не розчиняються. Для цього достатньо видаляти надлишкову иоду і укласти зрізи в гума-сироп, гліхрогель, гліцерин - желатин і т. Я.
Висновок в смоли.
Після просвітлення в ксилолі забарвлених звичайними методами зрізів їх укладають найчастіше в смоли. Раніше в якості середовищ для укладення використовували розчини канадського бальзаму або даммаровой смоли, згущеного кедрового масла, еупараля і ін. В ксилолі і хлороформі. В канадський бальзам зрізи укладають після фарбування гематоксиліном або еозином.
Для укладення зрізів, забарвлених аніліновим синім і кислотним фуксином, Кертіс запропонував підкислити бальзам саліцилової кислотою. Частина розчину бальзаму в ксилолі розбавляють до консистенції рідкого сиропу, насичують кристалами саліцилової кислоти, фільтрують через фільтрувальний папір і змішують з рівним об'ємом вихідного розчину. Якщо розчин пересичений, в препаратах часто виступають кристали саліцилової кислоти.
Всі перераховані вище смоли непридатні для укладення зрізів, забарвлених за методом Романовського, так як синій компонент барвника в цьому середовищі поступово вицвітає.
Висновок в смоли і сиропи здійснюють наступним чином. Підбирають покривні скла відповідних розмірів, щоб вони закривали зрізи, в Росії прийнято розміри 18X18, 20X20, 24X24, 24X36, 24X76 мм і ін.
На покривне скло по центру наносять краплю або, якщо скло довге, дві краплі рідкого розчину смоли в ксилолі. Покривне скло поміщають краплею вгору на фільтрувальну папір. Якщо зрізи укладають в розчини смол в ксилолі, одночасно можна підготувати до 6 покривних стекол, але для укладення заморожених зрізів в сироп краще готувати по одному склу. Предметне скло з пофарбованим зрізом виймають з ксилолу або води (в залежності від проводки), підсушують і тримають його похило зрізом вниз над покривним склом, так щоб один його довгий кінець стосувався фільтрувального паперу поруч з покривним склом. Потім предметне скло обережно опускають, поки зріз не торкнеться краплі розчину смоли або сиропу на покривному склі. Крапля розтікається до країв покривного скла. Якщо під покривне скло потрапляють бульбашки повітря, їх можна видалити, обережно натискаючи на покривне скло кінчиком препаровальной голки або злегка піднімаючи один його край; іноді досить просто додати смоли або сиропу. Потім дають стекти надлишку смоли, тримаючи предметне скло зрізом вниз під кутом близько 30 °, і, притискаючи до нього покривне скло, сушать його краю фільтрувальної папером. Після цього препарати поміщають на планшет і ставлять в тепле місце для сушіння.
Краї покривного скла не слід витирати ватою або марлею, змоченою ксилолом, так як при цьому частина смоли може розтектися по чистій поверхні покривного скла. Засихаючи, вона утворює нерівності, які заважають спостереженню під мікроскопом і від яких дуже важко позбутися.
Якщо зрізи укладають в трікапрат целюлози, то надлишок його засихає по краях покривного скла у вигляді маленьких твердих кульок, які легко зрізати маленьким ножем або зняти нігтем.
При укладанні великих зрізів для топографічного вивчення, наприклад, молочної залози, великих півкуль мозку, кісток людини і т. П. Між зрізом і покривним склом вже після укладення часто накопичується повітря. Щоб уникнути цього рекомендується використовувати більш концентровані розчини смол, які нагрівають для зменшення в'язкості. Полістироли не підходять для цієї мети, так як їх розчини мають велику в'язкість при порівняно низьких концентраціях.
Більш зручні канадський бальзам, нейтральні ефірні смоли і деякі цикло-парафінові і терпенові смоли; зрізи можна укладати в злегка нагріті 60-80% -ві розчини цих речовин в ксилолі.
В результаті неповного зневоднення в забарвлених укладених препаратах часто утворюються непрозорі або каламутні зони. Під мікроскопом в такій ділянці зрізу і над ним виявляються численні дрібні крапельки води, забарвлення сильно вицвітає. Щоб позбутися від цього, знімають покривне скло, змивають ксилолом синтетичну смолу або бальзам, зневоднюють зріз у 100% -му спирті, ацетоні або ізопропілового спирту, прояснюють в суміші ксилолу з обезводжуючим агентом і в 2-3 змінах свіжого ксилолу і знову укладають.
Якщо забарвлення знебарвилася, зрізи можна забарвити знову. Для цього препарат витримують в ксилолі (до декількох годин, поки не відокремиться покривне скло) і потім проводять через 100% -ний спирт і відповідні розчини, як зазвичай.
Аналогічним чином діють, якщо в розпорядженні дослідника є тільки пофарбований зріз, який було б бажано забарвити по іншому методу. У разі необхідності первинну забарвлення можна знебарвити підкисленим спиртом; зрізи потім ретельно промивають водою і забарвлюють за новим методом. Зазвичай зрізи, забарвлені спочатку залізним гематоксиліном, вже непридатні для проведення реакції з феррицианида калію на залізо, оскільки при цьому буде реагувати також і залізний лак.
Якщо на предметному склі змонтовані два зрізу одного блоку, я іноді офарблюю заново тільки один зріз, залишаючи інший під покривним склом.
Зрізи із залитих в нитроцеллюлозу тканин можна приклеювати до предметних стеклах або перед фарбуванням, або після нього. Зрізи виловлюють з посудини на чисте предметне скло і розправляють; скло при цьому тримають похило наполовину зануреним у воду, потім зріз ретельно промокають фільтрувальної папером.
Якщо зріз ще не пофарбований, його можна обробити парами ефіру; при цьому нитроцеллюлоза розм'якшиться і щільно приклеїться до предметного скла. Можна також опустити скло на кілька секунд в 0,5% -ний розчин нітроцелюлози в суміші ефіру зі спиртом, насухо витерти нижню поверхню предметного скла і занурити його для ущільнення плівки в хлороформ на 5-10 хв. Зрізи потім послідовно проводять через 95 і 80% -ний спирти в воду (зрізи тканин, фіксованих в рідинах з сулемою, перед перенесенням в воду обробляють 0,5% -ним розчином йоду в 70% -ному спирті 10-15 хв, а потім 5% -ним розчином тіосульфату натрію 5-10 хв). Зрізи можна перенести і безпосередньо в розчин барвника, якщо він приготовлений на водному спирті. Після фарбування надлишок барвника відмивають, як це прийнято для даного методу.
Целлоидин - один з видів нітроцелюлози, складного ефіру целюлози азотної кислоти. Ліллі називає целлоидин продукт з відносно низьким молярним вагою, а нитроцеллюлозой - більш в'язкий продукт з великою молекулярною вагою. У практиці вітчизняних лабораторій прийнято користуватися одним терміном - целлоидин.
«Вільні» нітроцелюлозні зрізи.
Деякі дослідники вважають за краще фарбувати целлоідіновие і нітроцелюлозні зрізи до монтування їх на предметні скельця. Це особливо зручно при лабораторних заняттях, коли доводиться готувати велику кількість зрізів з одного блоку.
В цьому випадку з 80% -ного спирту, в якому зберігаються зрізи, їх, переносять в спиртові розчини барвників або відразу, або проводять попередньо через 70 і 50% -ний спирти і воду. Якщо треба видалити ртутний осад, зрізи проводять через 0,5% -ний розчин йоду в 70% -ному спирті, розчин тіосульфату натрію і воду. Переносять зрізи злегка зігнутим шпателем, притримуючи, якщо необхідно, препаровальной голкою.
Зневоднення іпросветленіе нітроцелюлозних зрізів.
Після фарбування вільні зрізи зневоднюють, прояснюють, проводячи послідовно через ті ж розчини, які використовуються для нітроцелюлозних зрізів, наклеєних на предметні скельця. Останні обробляють так само, як і парафінові зрізи і целлоідінірованние парафінові зрізи.
Зрізи, пофарбовані найбільш стійкими барвниками, зневоднюють в 95% -ному спирті, прояснюють в карбол-ксилоле Вейгерта [8], який являє собою суміш, що складається з однієї частини розплавленого кристалічного фенолу і трьох частин ксилолу, промивають в 2-4 змінах ксилолу та укладають в депекс, пермаунт, канадський бальзам або іншу підходящу смолу, як і парафінові зрізи.
Знебарвлення нітроцелюлози в зрізах.
У разі необхідності забарвлену основними аніліновими барвниками нитроцеллюлозу можна знебарвити 2% -ним спиртовим розчином каніфолі, потім збезводнити зріз і просветлить, як описано вище або по одному з методів, описуваних нижче.
Просвітлення зрізів, забарвлених легко екстрагуються барвниками.
Зрізи, пофарбовані основними аніліновими барвниками, які екстрагуються карбол-ксилолом, Вейгерта [8] рекомендує просвітлювати в декількох змінах ксилолу; перед тим як переносити зрізи в наступну зміну розчинника, їх підсушують фільтрувальним папером.
Заморожені зрізи, забарвлені для виявлення жирів, виловлюють на чисті предметні скельця. Один край зрізу при цьому утримують на частково зануреному у воду склі, яке потім обережно виймають, так щоб зріз розпластався на поверхні скла. Складки на зрізі розправляють, знову погрожує його в воду. Іноді зрізи розправляють за допомогою препаровальной голок, особливо якщо вони розірвані або мають неправильну форму. Розправлений зріз обсушують, акуратно промокаючи його гладкою фільтрувальної папером. Потім зріз укладають в сприятливе середовище, кал описано вище. Для укладення тимчасових препаратів можна використовувати гліцерин. Препарати можна підготувати для більш тривалого зберігання, ретельно підсушуючи місця з'єднання предметного і покривного скла і окантовивая їх розчином канадського бальзаму в ксилолі або толуолі, а також нітроцелюлозним клеєм. Укладаючи зріз в маленьку краплю гліцерину, яка не доходять до притулку покривного скла, до окантовивая краю полістиролом, можна отримати досить довго зберігаються препарати.
Окантовка препаратів полістиролом.
Препарати, укладені в гліцерин-желатин або арлекс -желатін, окантовують 20% -ним розчином полістиролу в ксилолі, який наносять скляною паличкою по краях покривного скла. Через 1 годину препарат підсихає і перестає прилипати, і його можна покласти на наступний ранок разом з іншими препаратами, не побоюючись, що вони склеяться. Можна також покористуватися для цієї мети суміш ксилолу та капрата целюлози.
Ланоліновая смола рекомендується Ромейс як найбільш підходяще засіб для окантовки зрізів, укладених в водорозчинні середовища. Для її приготування 20 г безводного ланоліну сушать, нагріваючи при помішуванні в порцеляновій чашці 15 або 20 хв. Потім, не припиняючи перемішування, поступово додають 80 г каніфолі, поки не утвориться прозора світло-коричнева рідина. Краще нагрівати її на електричній плитці з закритою спіраллю, щоб уникнути займання. Отриману суміш розливають в маленькі чашечки і залишають для затвердіння. Скляну паличку або металевий шпатель сильно нагрівають, відокремлюють з їх допомогою трохи ланолінової смоли і закріплюють нею кути покривного скла. Потім краю скла окантовують великою кількістю гарячої розплавленої смоли.
Для отримання постійних препаратів зазвичай використовують середовища, що містять гуміарабік або желатин. Гуміарабік через деякий час підсихає до твердого стану, а желатин перед використанням розплавляють. Склад декількох успішно застосовуються середовищ наведено в табл.