Після оцінки на життєздатність ембріони двічі промивають в фосфатному буфері Дюльбекко з додаванням антибіотиків, засмоктуючих в мініпайету разом з невеликою кількістю середовища. Для пересадки використовують в перші 2-4 годин після вилучення з статевих шляхів донора.
Необхідність збереження життєздатності ембріонів більш тривалий час виникає у випадках: відсутність достатньої кількості відповідних реципієнтів; сумнівної якості вимитих ембріонів; створення банку ембріонів для здійснення довгострокових селекційних програм; обміну генофондом між країнами і континентами на комерційній основі. Існує кілька способів зберігання ембріонів: короткочасне поза організмом, короткочасне в організмі, довгострокове в зріджених газах. При розробці способу короткочасного зберігання ембріонів поза організмом був використаний досвід культивування тканин і клітин. Найбільш сприятливим середовищем виявилася ТСМ 199 з додаванням 20% ембріональної сироватки крові оленів. Ембріони зберігають в атмосфері збагаченої вуглекислим газом, при постійній температурі 37 градусів. В таких умовах вони залишаються життєздатними 24-48 ч. Є повідомлення про те, що зниження температури до 10 градусів дозволяє продовжити їх життєздатність до 5-6 діб.
Протягом 3-4 діб ембріони можна зберігати в яйцепроводов кролиць, виживаність складає в середньо 73%. В даний час цей спосіб не застосовується.
На сьогодні відомо 2 способи глибокого заморожування ембріонів: в програмованому режимі (ступеневу заморожування); одномоментний (вітрифікація).
При заморожуванні за першим способом відібрані ембріони (відмінного і хорошої якості) послідовно проводять через розчини кріопротектера (гліцерин або диметилсульфоксид) зростаючих концентрацій, приготовані на фосфатно-буферному сольовому розчині Дюльбекко з додаванням 20% фетальної сироватки. Після цього ембріони переносять в пробірки або ампули (по 1-4 в кожну) разом з 0,3 - 0,4 мл середовища з кріопротекторів. Ємності з ембріонами герметизують (пробірки закривають фольгою, ампули запаюють) і поміщають в камери заморажівателя, де охолоджують до -7 градусів в режимі 1 градус в хвилину. Температура досягне цієї позначки викликають кристалізацію середовища. Для цього в рідкому азоті пінцетом стосуються стінки пробірки (ампули) в зоні верхнього краю стовпчика середовища. Подальше охолодження (до -28 градусів або -35) ведуть зі швидкістю 0,5 градуса в хвилину, потім швидкість зменшують до 0,1 градус в хвилину; через 10 хвилин доводять до кінцевої температури зануренням в рідкий азот.
Одномоментне заморожування (вітрифікація) - затвердіння при надзвичайно високій в'язкості середовища, що веде до утворення склоподібних структур. Це можливо при високій концентрації кріопротектори і швидкому охолодженні.
Ефективність трансплантації ембріонів великої рогатої худоби в чому визначається умовами зберігання зигот. Найефективнішим і перспективним методом консервації ембріонів є їх глибоке заморожування (кріоконсервація) в рідкому азоті при температурі -196 градусів. Розробка методу довготривалого зберігання кріоконсервованих ембріонів значно розширює можливості трансплантації. Тільки в цьому випадку вона може бути надійною біотехнологічної основою селекційної програми.
Довготривале зберігання глибокозаморожених ембріонів має ряд переваг. Відпадає необхідність в утриманні великих стад або груп реципієнтів, так як пересадки можуть бути проведені в будь-який час незалежно від строків взяття ембріонів від донорів, що істотно підвищує рентабельність трансплантації. Крім того, кріоконсервація ембріонів дозволяє створювати ембріобанкі від генетично цінних тварин, а також зберігати генофонд рідкісних і зникаючих порід і транспортувати ембріони в будь-які країни світу. За оцінкою фахівців криоконсервация ембріонів економічно виправдана, вона виключає генетичний дрейф, тобто зміна частоти генів в популяції, викликані випадковими причинами. При дотриманні правильної біотехнології виживаність ембріонів становить 90%, а стельность корів-реципієнтів після нехірургічній пересадки знаходиться в межах 50-55%. Однак нерідко в виробничих умовах при недотриманні технології заморожування-розморожування виживаність ембріонів зменшується, що істотно знижує рентабельність кріоконсервації. Обґрунтовано, що використання методу кріоконсервації ембріонів в виробничих умовах є рентабельним лише в тому випадку, якщо виживаність ембріонів після розморожування буде не менше 80%, а відсоток тільності корів-реципієнтів складе 55-60%.
За прийнятою в Росії технології, ембріони заморожують із застосуванням автоматичних пристроїв, що забезпечують регулювання швидкості охолодження в заданих режимах. Після герметизації ємності з ембріонами ампули або пробірки маркують, потім охолоджують з 20 до -6 градусів зі швидкістю 1 градус в хвилину, проводять кристалізацію, охолодження зі швидкістю 0.3 градуса в хвилину і занурюють в рідкий азот. Застосовується також і інший режим: охолодження від -7 до -35 градусів зі швидкістю 0.3 градуса в хвилину; від -35 до -38 градусів зі швидкістю 0.1 градус в хвилину і занурення в рідкий азот. Відтавання ембріонів проводиться на водяній бані з температурою 25 або 37 градусів протягом 10-12 секунд. Для зберігання і транспортування заморожених ембріонів використовують судини Дьюара різних типів.
Практика кріоконсервації ембріонів великої рогатої худоби свідчить про те, що на виживаність ембріонів істотно впливає не тільки технологія глибокого заморожування і відтавання, а й їх якість і стадія розвитку. Для успішної кріоконсервації слід відбирати ембріони без морфологічних порушень, що знаходяться на стадіях пізньої морули або ранньої бластоцисти.
Необхідність відбору ембріонів диктується ще й тією обставиною, що у 10% з них виявляється неправильний розвиток, а при кріоконсервації пошкоджуються в середньому ще 25% клітин бластоцисти. Такі ембріони відчувають велику редукцію інтактних бластомерів, внаслідок чого пережіваемость і подальший розвиток після заморожування і відтавання істотно порушуються.
Якщо Ви помітили помилку в тексті виділіть слово і натисніть Shift + Enter