Експерименти з опроміненням плазмідної ДНК інфрачервоним світлом з довжиною хвилі 2,2 мікрона показали, що розриви ниток ДНК відбуваються не рідше, а частіше, ніж в ближньому ІЧ-діапазоні. Молекулярний механізм такого процесу пов'язаний зовсім не з електронами, що з'являються при поглинанні світла, а з гідроксил радикалами OH, які при великій пікової потужності випромінювання стають вращательно-збудженими і ефективно розрізають одну або обидві нитки молекули ДНК.
Вплив радіації на ДНК
Взагалі, руйнування ДНК під дією опромінення може відбуватися з різних причин. Сама банальна - це тепловий вплив, і саме воно в першу чергу приходить на розум, коли говорять про інфрачервоне випромінювання. Великий потік випромінювання, що потрапляє в живу тканину, призводить до локального енерговиділення, підвищенню температури, через що молекула ДНК розплітається або руйнується.
З точки зору молекулярної фізики, розрив нитки ДНК - це просто розрив деяких хімічних зв'язків. Подвійний розрив - це два таких події на обох нитках, що відбулися дуже близько один до одного. Якщо одноразовий розрив ще можна полагодити, добудувавши молекулу по другій (комплементарної) нитки, то подвійний розрив просто розрізає ДНК на частини. В принципі, організувати такий розрив нескладно - треба лише передати молекулі ДНК велику енергію, причому передати її треба безпосередньо. Ця енергія витягне з молекули кілька електронів, хімічні зв'язки в ній порушаться, і нитки зможуть розірватися. Такі процеси починаються вище порога іонізації ДНК, який становить кілька десятків МеВ. Для іонізуючого випромінювання високої енергії це і є основний механізм впливу. Частка з енергією в мегаелектронвольт за рахунок іонізації речовини виробляє на своєму шляху кілька тисяч електронів на кожен МеВ втраченої енергії, і кожен з цих електронів має шанс розірвати нитку ДНК. Однак для частинок меншою енергії такий розрив за рахунок «грубої сили» вже не працює. Наприклад, енергія одного оптичного фотона становить всього 2 еВ, що істотно менше порога іонізації; енергія інфрачервоних фотонів і того менше. Крім того, під дією випромінювання енергія набагато частіше виділяється не безпосередньо в молекулі ДНК, а в рідини поруч з нею. Тому виникає питання про те, чи може ця (і без того невелика!) Енергія передатися ДНК, призводить вона до розриву ниток, і якщо так, то як саме це відбувається.
Роль гідроксил-радикалів
Електрони, вибивані іонізуючим випромінюванням, зазвичай вважаються основним джерелом різноманітних проблем для ДНК. Однак справа не тільки в них. Три роки тому було показано. що утворюються під дією інфрачервоного (ІК) світла гідроксил-радикали (молекули OH) теж відіграють важливу роль в цьому процесі. Це «обривки» молекул води, які виникають при впливі сильного світлового поля. Спочатку лазерний імпульс породжує безліч порушених (H2 O *) і іонізованих (H2 O +) молекул води, які потім стикаються один з одним і обмінюються протоном: H2 O * + H2 O + → OH + H3 O +. Гідроксил-радикали нестабільні, вони із задоволенням відбирають атом водню у навколишньої речовини, якщо воно є в наявності. Радикали OH, що утворилися поблизу молекули ДНК, доходять до неї і за рахунок багаторазових зіткнень відбирають один з її атомів водню, перетворюючись в молекули води. Втрата водню в «кістяку» ДНК-нитки призводить до перебудови хімічних зв'язків і розриву нитки.
Мал. 2. електрофорезні визначення просторової конфігурації плазмідної ДНК. Три різних форми рухаються з різною швидкістю під дією електричного поля. За відносної яскравості смужок можна визначити відсоток ДНК кожної форми. На фотографії справа показано, що до опромінення (-) майже вся ДНК знаходиться в сверхспіральном стані, а після опромінення (+) переходить в інші форми. Зображення з обговорюваної статті
Для цього експериментатори використовують плазміди бактеріальних ДНК - невеликі згорнуті в кільце шматочки молекули ДНК, які в своєму звичайному стані знаходяться в формі «суперскрученості» спіралі (так звана сверхспіралізаціі ДНК). Здатність до сверхспіралізаціі - важлива характеристика ДНК, яка допомагає компактному її зберігання та виконання своїх функцій. Розрив однієї нитки дозволяє сверхспіралі розплутатися - вона переходить в «розслаблену» форму; подвійний розрив перетворює її в лінійну молекулу (рис. 1). Всі ці три форми ефективно розділяються за допомогою стандартної методики гелевого електрофорезу (рис. 2), оскільки вони «повзуть» під дією електричного поля з різною швидкістю. Тому, порівнявши полосочки до опромінення і після опромінення, можна по їх яскравості дізнатися, який відсоток сверхспіралізованних плазмід набуває розслаблену або лінійну форму.
Для з'ясування того, який з молекулярних механізмів розриває ДНК, експериментатори додають в розчин спеціальні речовини, які швидко поглинають вільні електрони або вільні OH-радикали, нейтралізуючи їх дію. Вимірюючи відсоток розривів ДНК в залежності від концентрації електрон-нейтралізують або радикал-нейтралізують агентів, можна зробити висновки щодо їх ролі в руйнуванні ДНК. Наприклад, якщо електрони відіграють важливу роль в руйнуванні ДНК, то при їх нейтралізації кількість розривів сильно зменшиться. Якщо вони не грають ролі - воно не зміниться.
Мал. 3. Зміни плазмідної ДНК pBR322 до опромінення (-) і після опромінення (+). Зліва. опромінення на довжині хвилі 1,35 мкм, праворуч. на довжині хвилі 2,2 мкм. Чорним, червоним і синім кольорами показані вихідна (сверхспіральная), розслаблена і лінійна конфігурації, відповідно. Зображення з обговорюваної статті
Зазвичай вважається правдоподібним, що чим більше довгохвильове випромінювання ми використовуємо, тим слабкіше - при фіксованій потужності - повинні бути викликані ним ефекти, оскільки енергія окремих фотонів стає менше. Результати нових експериментів повністю суперечать цьому припущенню. З'ясувалося, що випромінювання на довжинах хвиль 1,35 мкм і 2,2 мкм руйнують ДНК сильніше. ніж в попередніх експериментах з ближнім ІЧ-світлом. Після трьох хвилин опромінення практично вся сверхспіральная ДНК в зразку отримала розриви по крайней мере в одній нитки (рис. 3). Більш того, на 2,2 мкм істотна частка всіх ДНК отримує подвійний розрив і стає лінійної (саме цей факт і підкреслюється на рис. 2 і 3).
Для доказу того, що довгохвильове ІЧ-випромінювання діє на ДНК за рахунок OH-радикалів, а не електронів, експериментатори провели серію вимірів з добавками нейтралізують агентів з різною концентрацією. З'ясувалося, що нейтралізатори електронів практично не змінюють відсоток розривів ДНК, а нейтралізатори OH-радикалів різко його знижують. Більш того, відсоток лінійної ДНК падає з ростом концентрації OH-нейтралізатора набагато швидше, ніж відсоток розслабленою. Це означає, що механізм подвійної розриву ДНК - це швидше за все не одноразовий удар OH по молекулі, відразу руйнує обидві нитки, а два близьких, але незалежних удару, кожен з яких розщеплює свою нитку. До сих пір це питання не буде підтверджено експериментально.