АЛГОРИТМ ДІАГНОСТИКИ респіраторних та АСОЦІАТИВНОГО мікоплазмоз ПТАХІВ
A.П КРАСИКОВ, доктор ветеринарних наук, професор. Омський державний аграрний університет імені П. А. Столипіна krasikovl 950 @ mail. ru
І.Г. ТРОФІМОВ, доктор ветеринарних наук, професор Омський державний аграрний університет імені П. А. Столипіна
Н.Ф.ХАТИЮ, кандидат ветеринарних наук, зав. відділом молекулярної біології Державної установи Омська обласна лабораторія.
С.Б.ЛИСКО. кандидат ветеринарних наук, зав. відділом ветеринарії Сибірського НДІ птахівництва РАСХН
О.А.СУНЦОВА, кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник відділу ветеринарії НДІ птахівництва РАСХН
РЕЗЮМЕ / SUMMARY. Розроблено, експериментально обгрунтовані і запропоновані ве терінарной практаке експрес-методи бактеріологічної і серологічної діагностики респіраторного мікоплазмозу птахів і асоційованих форм його прояву.
Developed and experimentally substantiated and offered veterinary practice available Express-methods ofbacteriological and serological diagnostics of respiratory mycoplasmosis are considered birds and associated forms of its manifestation
Ключові слова: мікоплазмоз птахів, епізоотологичеськие, клінічні, патологоанатомічні, імунологічні, методи діагассгікі.
Keywords: mycoplasmosis of birds, epizootologichesky, clinical, pathoanatomical, immunological, diagnostics methods.
Мета досліджень. Вивчити епізоотичну обстановку по респіраторному мікоплазмозу птахів і асоціативним формам його прояви в Сибірському регіоні і вдосконалити лабораторні методи його діагностики.
Респіраторний мікоплазмоз зареєстрований на чотирьох (33,3%) птахофабриках Омської області, на одній - Новосибірської області (9%) і на 9-ти (47%) Алтайського краю. Найчастіше мікоплазмоз протікає в асоціації з ешеріхіозов, стафілококоз, рідше з пастереллезом і реовирусной теносіновіта. Причому з усіх асоціацій ешеріхиоз зустрічається найбільш часто. Так, на одній з -ісследуемих птахофабрик Омської області мікоплазмоз в асоціації з ешеріхіозов виявлено в 72% випадках. Найбільш часто зустрічаються серотипи кишкової палички: 01, 03, 020, 078, О103, 0111, 0119. В межах одного господарства виділяли два, рідше - три серотипу.
Аналізуючи результати бактеріологічних і серологічних досліджень, потрібно зазначити, що, незважаючи на відсутність вираженої клінічної картини респіраторного мікоплазмозу, збудник присутній в ряді птахівницьких господарств Омської області та Алтайського краю. При цьому джерелом інфекції є не тільки кури, а й півні, виділяючи мікоплазми зі спермою, сприяючи тим самим подальшому поширенню збудника. Встановлено, що найбільш чутливі до зараження респіраторним асоціативним мікоплазмоз, з розвитком комплексу клінічних ознак, курчата у віці 1-50 днів. При цьому в структурі загибелі молодняка частка інфекційних хвороб становила 67,3%, з них 100% припадало на мікоплазмоз в асоціації з колибактериозом (ешеріхіозов). Перехворілий молодняк відставав у рості і розвитку. Кури-несучки і півні, не мають видимих клінічних ознак хвороби, є прихованими носіями збудника респіраторного мікоплазмозу та джерелом інфекції для потомства. Так, за результатами бактеріологічних досліджень, найбільша кількість курей мікоплазмоносітелей (60%) виявлено в пік яєчної продуктивності (220 днів), при цьому середній титр антитіл в ІФА становив 7387 ± 1253. Кількість же птахів мікоплазмоносітелей збільшувалася з віком і до 372 дням досягало 70%, а число реагуючих в ІФА - до 82% із середнім титром 5165 ± 137.
Індикація мікоплазм у 43% ембріонів, а також наявність антитіл у добових курчат (64,8%), виявлення у них М. gallisepticum (55%) свідчить про передачу інфекції трансоваріальним шляхом, який є основним. Крім того, значна кількість культур М. gallisepticum було виділено зі сперми півнів, що свідчить про її інтенсивної обсіменіння і зараженні нею курей, особливо при їх штучному заплідненні поліспермії.
За нашими спостереженнями в спонтанних умовах птах сприйнятлива до ешеріхіозов з добового, а до респіраторного мікоплазмозу - з 20-денного віку. Поширенню респіраторного мікоплазмозу та ешеріхіоза на птахофабриках Омської області сприяють сприятливі фактори: порушення температурного режиму, недостатній повітрообмін, переущільнення птиці, застосування живих вакцин проти вірусних інфекцій. При цьому м'ясна птиця більш сприйнятлива до мікоплазмозу, ніж птах яєчних порід: число позитивно реагують курей досягає до 300-денного віку 100% і утримується на цьому рівні до кінця життя. Асоціативні форми перебігу респіраторного мікоплазмозу ускладнюють епізоотичну ситуацію, ускладнюють діагностику, профілактику і заходи боротьби з ним.
При експериментальному відтворенні асоційованого перебігу респіраторного мікоплазмозу з ешеріхіозов у курчат нами встановлено, що інкубаційний період становить 6-18 годин. Клінічний прояв хвороби в початковий період характеризується загальним пригніченням, відмовою від корму, важким диханням, скуйовдженим оперенням, скучіваніе птиці невеликими групами. Надалі пригнічення посилюється, птах не реагує на подразник, у неї спостерігається розлад травлення, дихання. При спонтанному зараженні у курчат спостерігали подібні, але менш виражені клінічні ознаки. У проведеному експерименті загибель птиці спостерігали через 8 годин після зараження, яка тривала до 8 днів. На 3-4-й день після зараження відзначали одно- або двосторонній риніт, задишку, трахеї-альні хрипи, а на 9-й день загальний стан кілька поліпшувалося, хрипи ослабли. Через 12 днів після зараження стан птиці було задовільним, хрипи були відсутні.
Основні патологоанатомічні зміни при респіраторному микоплазмозе, асоційоване з ешеріхіозов, локалізувалися в серці, легенях, повітроносних мішках, печінки, селезінці, кишечнику у вигляді серозного, серозно-фібринозного і фібринозного запалення. Участь Е. coli в асоціативному інфекційному процесі виявляється розвитком фібринозного запалення перикарда, капсули печінки, повітроносних мішків і очеревини.
Методи оцінки Т- і В-систем дозволили розкрити механізми функціонування імунної системи і виявити порушення в системі імунного гомеостазу у інфікованих курчат. В результаті проведеного дослідження встановлено збільшення абсолютного і відносного кількості лейкоцитів і нейтрофілів, особливо в перший тиждень після зараження, що є відповідною імунологічної реакцією на збудників М. gallisepticum і Е. coli. Псевдоеозінофіли, як найбільш рухливі клітини, з'являються першими в місці вторгнення чужорідного агента і стимулюють функціональну активність моноцитів, еозинофілів і лімфоцитів, виконуючи захисну функцію в ході запальних процесів.
Зниження абсолютної кількості лімфоцитів через 14-21 день після зараження вказує на пригнічення розвитку лімфоїдної системи, гальмування лімфопое через, що негативно позначається на функції імунітету і супроводжується зниженням абсолютної кількості Т і В-лімфоцитів у інфікованих курчат на 14-21-й день . Це підтверджується гістологічними дослідженнями: делімфоцізаціей лімфоїдних фолікул фабріціевой бурси, зменшенням кількості лімфоцитів і зникненням коркового шару в часточках тимуса. Інволюція бурси, в свою чергу, пов'язана з пригніченням в ній синтезу імуноглобулінів. У зв'язку з атрофією центральних органів імунної системи (тимусу та фабріціевой бурси), їх функції певною мірою реалізуються вторинними лімфоїдними органами (селезінкою і печінкою), що підтверджується імунологічними і морфо-функціональними змінами в цих органах при гістологічних дослідженнях.
Зростання кількості В-лімфоцитів (через 7, 14 і 21 день після інфікування) пояснюється посиленням імунологічної реакції селезінки, яка проявляється формуванням безлічі лімфоїдних фолікулів, що складаються з великих і малих лімфоцитів, молодих плазматичних клітин. Це узгоджується з твердженнями N. L. Payne (1971) про поглинання антигенів та освіті антитіл лімфоїдними клітинами червоної і білої пульпи селезінки. Періоди зростання В-лімфоцитів збігаються з періодами утворення антитіл до збудника М. gallisepticum. що підтверджується даними серологічних досліджень. Так, через 7 днів після зараження в СКРА виявили 15% позитивно реагують курчат, а до 14 і 21-му днях дослідження - 100%. За допомогою ІФА була простежується динаміка накопичення антитіл. Через 7 днів після інфікування середній титр по групі склав 89,0 ± 0,9, до 14-го дня - 874,0 ± 16,1 і на 21-й день -1319 ± 76,98, при цьому залишаючись на рівні, незначно перевищує діагностичний титр (1: 800). Наростання рівня антитіл у курчат дослідної групи вказує на стан їх інфікованості М. gallisepticum.
При бактеріологічному дослідженні курчат дослідної групи у всіх вікових періодах були ізольовані вихідні культури Е. coli і М. gallisepticum. в контрольній интактной групі патогенної мікрофлори на всьому протязі досвіду не виявлено.
Таким чином, зараження курчат М. gallisepticum і Е. coli викликає значні зміни в Т- і В-систе-мах імунітету і картині крові. Імунодефіцитний стан в даному випадку - це набутий дефект імунної системи, що виражається в нездатності організму в повній мірі здійснювати реакції клітинного і гуморального імунітету. Причиною імунологічної недостатності з'явилася рання інволюція центральних органів імунної системи (тимусу та бурси), яка виражається делімфотізаціей і кістозним переродженням лімфоїдних фолікулів і розростанням міжфолікулярних тканини бурси, а також зникненням коркового речовини, переміщенням лімфоцитів в мозкову зону, освіта кістозних порожнин, зменшенням часточок тимуса і оточенням їх жировою тканиною.
В даний час починають з'являтися нові розробки спеціальних поживних середовищ для виділення мікоплазм і уреаплазм. Разом з тим, до цих пір не створені універсальні промислові серійно випускаються середовища з відпрацьованої технологічною основою виробництва, які б забезпечували зростання всіх мікоплазм, включаючи і уреаплазми. Наявні прописи складів живильних середовищ для діагностики мікоплазмозів і уреаплазмоза не є стандартними, і тому можуть бути незначні відмінності в процесі їх приготування, залежні від якості м'яса, що використовується для приготування поживної основи. Вони вимагають автокла-вірованія, стерилізації та мають мінімальні терміни зберігання.
Пропоновані нами середовища відповідають пропонованим до них вимогам. Оригінальний склад інгредієнтів представлений основою з уніфікованим набором стандартних поживних компонентів і внесеними необхідними збагачують добавками, певною кількістю індикатора, оптимальним набором і концентрацією антибіотиків, сироваткою крові, оптимальним значень рН на різних стадіях технологічного процесу. Відпрацьована стандартна технологія отримання рідких діагностичних середовищ для індикації микоплазм респіраторного тракту, включає отримання основи з додаванням в неї поживних компонентів і відповідних субстратів ферментативної активності (глюкоза, аргінін, сечовина), сироватки та антибіотиків, а також стерилізуючу фільтрацію і заключну пастеризацію. Також технологічно обгрунтований процес отримання сухих основ щільних середовищ, що дає можливість ідентифікувати виділені культури за характером росту колоній. Використання діагностичних середовищ дозволяє здійснювати індикацію і групову диференціацію мікоплазм, а також за допомогою титрации оцінювати ступінь їх накопичення в цветообразующие одиницях (Цоя) або колонії утворюють одиницях (КУО).
Якісні характеристики пропонованих нами середовищ були вивчені у відповідних дослідах по визначенню чутливості і специфічності рідких, напіврідких і щільних поживних середовищ для індикації аргінін- глюкозоферментірующіх мікоплазм, уреаплазм.
Аналіз результатів проведених дослідів показав, що поживні середовища, розроблені нами спільно з НІІПОІ Росспоживнагляду, відповідають за всіма показниками, що пред'являються до них вимогам. А саме, мають високу чутливість до мікроорганізмів, що належать до класу Mollicutes; швидкістю росту тест-штамів М. gallisepticum і М. fermentans - протягом трьох діб і U. urealyticum - протягом доби; селективної здатністю, яка виражається в ингибиции даними живильними середовищами тест-штамів Staphylococcus aureus WHO-2, Proteus mirabilis, Escherichia coli 9001, яка не впливає на швидкість росту мікоплазм і уреаплазм, а властива їм стабільність біологічних властивостей дозволяє зберігати рідкі середовища в умовах холодильника до 6-ти місяців.
Сухі діагностичні середовища для індикації глюкозо і аргінінферментірующіх мікоплазм і уреаплазм також відповідають пропонованим до них вимогам. Дані середовища економічні, зручні в застосуванні. Їх можна використовувати в якості основ для приготування щільних і напіврідких середовищ, що підвищує їх діагностичну цінність, терміни зберігання і спрощує транспортування.
Висока чутливість середовищ забезпечує зростання на щільному і напіврідкої середовищі не менше ніж 1,0x105 КУО. Швидкість зростання тест-штамів М. gallisepticum на щільному середовищі п'ять - і на полужидкой - три доби, М. fermentans-п'ять і чотири доби і U. urealyticum - четверо і три доби. Селективна здатність виражена в ингибиции даними живильними середовищами зростання тест-штамів Staphylococcus aureus WHO-2, Proteus mirabilis, Escherichia coli 9001 та відсутність такої, на мікоплазми та уреаплазми. Біологічні властивості середовища в умовах холодильника зберігаються до року. Пропонований нами культуральний метод простий в постановці, не вимагає спеціального устаткування і дозволяє проводити як індикацію, так і диференціацію збудників, визначати їх титри.
Рекомендовані методи бактеріологічної і серологічної діагностики були вивчені в експериментальних умовах на курчатах-бройлерах. В результаті проведеного експерименту було показано, що спеціальні діагностичні поживні середовища для індикації мікоплазм і уреаплазм активні і чутливі щодо даних мікроорганізмів, в той же час стабільно інгібують зростання інших мікробів, що знаходяться в асоціації з мікоплазмами. Серологічне дослідження підтверджує дані бактеріологічного дослідження, а РНИФ є додатковим високочутливим і специфічним методом діагностики мікоплазмозной інфекції. При дослідженні в РНІФ патологічного матеріалу від курчат зі специфічними кролячими мікоплазмозной сироватками на наявність антигену показана висока специфічність тесту: у всіх випадках перехресних реакцій між супутньої мікрофлорою і мікоплазмами не було виявлено.
Виробниче випробування запропонованої схеми діагностики асоціативного микоплазмоза на птаху різних статевовікових груп підтверджує дані експериментальних досліджень, а саме: запропоновані методи ефективні й інформативні щодо мікоплазмозной інфекції. Так, на спеціальних поживних середовищах для виділення мікоплазм і уреаплазм Інги-біруется зростання супутньої мікрофлори, без негативного впливу на зростання мікоплазм, при цьому індикація на рідких середовищах була паралельно підтверджена результатами зростання на щільних середовищах. У серологічного тесту (РНІФ) спостерігали високу чутливість. За допомогою даного методу було виявлено мікоплазмозной антиген в спермі півнів, тим самим була визначена роль останніх в поширенні мікоплазмозу в батьківському стаді. При порівнянні бактеріологічного і серологічного методів встановлено, що результати даних досліджень, як правило, відповідають один одному, що сприяє уточненню і підвищенню достовірності діагностики.
2. коромисла Г.Ф. Методичні рекомендації по біохімічним і імунологічних методів дослідження клітин, їх компонентів та інших біологічних субстратів / Г.Ф. Коромисло, Н.М. Клімов, Д.Д. Полоз // ВІЕВ. -ВАСХНІЛ. - М: [б. в.], 1980. - 39с.
3. Payne, N.L. The lymphoid system. - In Physiology and biochemistry of the domestic fowl / N.L. Payne. - London, New-York: Acad. Press. 1971. - № 2. - p. 985-1037.
4. Митрофанов, П.М. Імунопатологія при микоплазмозе тварин / П.М. Митрофанов, Х.З. Гаффаров, Р.В. Боровик // Ветеринарія. -1984. - № 5. - С. 35-37.