Винахід відноситься до збагаченим гідроксипролін глікопротеїну, які можуть бути отримані з рослинних джерел, і до їх фармацевтичному і косметичному використання.
Відомо, що деякі глікопротеїни тваринного походження, такі як колаген і протеоглікани, проявляють благотворну дію на шкіру при місцевому нанесенні як такі або коли вони включені в відповідні препаративні форми.
Колаген, що є глікопротеїном, багатим пролином і гідроксипроліну, застосовують особливо, як такої або в комбінації з іншими поліпептидними підставами при лікуванні від зморшок і інших неестетичних плям, пов'язаних з поганою гідратацією і еластичністю шкіри. Однак колаген тваринного походження має обмеження в його використанні внаслідок ризику забруднення вірусами і токсинами. Хоча сполуки рослинного походження не пов'язані з подібним ризиком, до сих пір їх використання в косметиці було вкрай обмеженим: наприклад, відомі косметичні препаративні форми, які містять неочищені екстракти таких рослин, як Aloe або навіть цілі подрібнені рослинні продукти, такі як авокадо.
Відомі рослинні глікопротеїни, звані естенсінамі, які отримують з клітин рослин в стадії проліферації і які мають структуру, подібну колагену тварин. В EP-A-05334078 описується косметичний застосування екстенсінов, що мають середню молекулярну масу понад 100000 Дальтон. Однак способи екстракції екстенсінов, описані до теперішнього часу, які передбачають екстракцію рослинних матеріалів різного походження за допомогою водних сольових розчинів з подальшим очищенням сильними кислотами, такими як трихлороцтової кислота, не дозволяють отримувати продукти, які підходять для косметики, внаслідок проблем, що відносяться до розчинності, відтворюваності і стійкості їх хіміко-фізичних характеристик.
В даний час виявлено, що можна отримати багаті гідроксипролін глікопротеїни, структурно подібні до вищеописаними екстенсінамі, але з меншою мовляв. масою і більш високу розчинність в кислотних водних розчинах, за допомогою способу, що включає культивування in vitro клітин обраних рослин і екстракцію кислотно-спиртовими розчинами клітин, що ростуть у відповідній середовищі.
Глікопротеїни, одержувані згідно з винаходом, мають гидратирующие, плівкоутворювальні, тонують і сприяють рубцюванню властивості, більш високого рівня, ніж властивості колагену. Глікопротеїни даного винаходу можуть, отже, застосовуватися в косметичних або дерматологічних препаративних формах для лікування сухої шкіри, псоріазу, іхтіозу, лупи, кератозу, зморшок, вугрів, екземи, запального дерматозу, старіння шкіри і у всіх інших областях застосування, для яких передбачалося застосування тваринного колагену.
Водні розчини гликопротеинов даного винаходу залишаються стабільними без будь-якої полімеризації гликопротеинов, що веде до утворення нерозчинних продуктів. Крім того, в'язкість цих розчинів особливо висока і не залежить від концентрацій; 0,1% концентрації несподівано мають ту ж саму плівкоутворювальній і гидратирующие силу, яку мають розчини 1% колагену або 5% рослинного альбуміну.
Рослинну тканину каллуса після стерилізації та необов'язкового додавання антибактеріальних агентів зазвичай використовують для інокулюму відповідних рідких культуральних середовищ, як описано в вищезгаданому керівництві Dobbs і Roberts. Особливо сприятливим середовищем для даного винаходу є середовище Скуга і Мурашіге. Додавання специфічних добавок, таких як пролін, відновлюють агенти, етилен або з'єднання, здатні вивільняти етилен, такі як Ethephon або L- аміноціклопропанкарбоновая кислота, можуть бути придатними для збільшення продуктивності або вироблення бажаних гликопротеинов.
Перевага використанням нафтілуксусной кислоти, такої як ауксин, 6- (, -діметіламіно) -пуріна як цитокинина, вітамінів і 3% сахарози в якості джерела вуглецю.
Залежно від обраного матеріалу може бути корисним додавання вітаміну C для запобігання придбанню кінцевим продуктом коричневого кольору.
Час ферментації може варіювати від 3 до 12 днів і становить переважно, між 5-6 днів. Відразу ж після закінчення ферментації культуральне середовище центрифугируют і клітинну масу екстрагують спиртами, переважно етанолом, в присутності розведених мінеральних кислот, переважно, соляної або сірчаної кислоти. Дана процедура інактивує деякі ферменти, які можуть наражати на небезпеку стабільність гликопротеинов даного винаходу, зокрема, поліфенолоксідазу і тірозіноксідазу, які сприяють полімеризації гликопротеинов з подальшим утворенням нерозчинних продуктів.
Спиртова екстракція в присутності мінеральних кислот уможливлює повну екстракцію основних глікопротеїнів, і виявилася в кінцевому підсумку вкрай вибірковою. Крім етанолу можна використовувати інші змішуються з водою спирти, такі як метанол або ізопропанол. Отримані водно-спиртові екстракти нейтралізують і потім концентрують і нагрівають до температури 70-100 o C, переважно близько 80 o C, до завершення осадження денатурованих білків. Потім суспензію освітлюють концентрування і рідина піддають фракційній ультрафільтрації для видалення високомолекулярних і низькомолекулярних речовин. Ультрафільтрацію виконують із застосуванням полісульфонова мембран, мають відсікання молекулярних мас 10000-40000 Дальтон, таких як Centricon R або Romicon R. волокна яких можуть бути порожніми або альтернативно скрученими. Отриманий відфільтрований продукт піддають Електродіаліз для видалення небажаних речовин, таких як солі і низькомолекулярні цукру. Після фільтрування та діалізу отриманий розчин можна використовувати як такої в косметичних або фармацевтичних препаратах або його можна сконцентрувати до меншого обсягу і потім ліофілізований або тонко подрібнювати.
Амінокислота - Площа піку,% Asp - 4,399 Glu - 4,328 Hyp - 17,505 Ser - 7,065 Gly - 6,056 Hys - 1,782 Arq - 2,471
Thr - 4,739
Pro - 10,036
Ala - 8,2
Туг - 2,388
Val - 6,162
Met - 1,154
Ile - 2,479
Leu - 5,525
Phe - 1,862
Lys - 14,254
Представлені вище дані відносяться до відсотка від загальної кількості амінокислот, присутніх в суміші глікопротеїнів. Сахара в цій суміші є арабинозу і галактозу. Ставлення амінокислот до цукрів одно в середньому 2: 1 для різних продуктів.
Як згадувалося вище, продукти даного винаходу можна використовувати як в області фармацевтики, так і в області косметики. Для фармацевтики продукт може включатися в гелі або мазі або наноситися на насичуються медичним препаратом марлі для спеціальної обробки опіків або ран. В даному випадку продукт зазвичай піддають стерилізації або стерильному фільтрування і ліофілізації.
Косметичні та дерматологічні препарати даного винаходу можуть бути приготовлені відповідно до традиційних способів. Прикладами форм введення є водні спреї, лосьйони, розчини, емульсії, гелі, мазі і креми.
Косметичні та дерматологічні препарати даного винаходу можуть містити багаті гідроксипролін глікопротеїни в кількості від приблизно 0,01 до приблизно 50 мас.%, Переважно від 0,05 до 5 мас.%, А також звичайні наповнювачі. З даної високою стабільністю гликопротеинов даного винаходу можуть бути отримані фармацевтичні та косметичні препарати, що містять більше 50% розчинних багатих гідроксипролін гликопротеинов.
Глікопротеїни даного винаходу можуть додаватися до фармацевтичних і косметичних препаратів як такі або вони можуть Мікроінкапсульовані таким чином, щоб забезпечити довгострокове гидратирующее дію. Мікрокапсули можуть бути або гідрофільними або липофильними. Препарати даного винаходу можуть включати інші активні інгредієнти, які мають доповнює або корисну активність для бажаних цілей.
Далі даний винахід ілюструється такими прикладами.
приклад 1
Отримання каллуса і рідкої культури Gingko biloba для виробництва гликопротеинов
Готують експлантати молодого листя Gingko biloba промиванням листя в розчині 0,1% Твін 80 (Tween 80 R). Листові пластинки розрізають на ділянки приблизно 0,5 см і попередньо стерилізують протягом 1 хв 75% -ним етанолом. Потім стерилізацію завершують 2% -ним розчином гіпохлориту натрію і триразовим промиванням експлантати в стерильній воді. Отримані експлантати переносять в чашку Петрі в середовищі Мурашіге і Скуга, що містить 3% -ву сахарозу, з додаванням вітамінів Лінсмейера і Скуга і гормонів, таких як 2,4-діхлорфеноксіуксусная кислота і нафтілуксусная кислота. Продукти инкубируют в темряві при 23 o C протягом 20 днів. В кінці цього періоду отримують пухкі каллусов, які легко ростуть і розвиваються безперервними рядами при субкультівірованія в тих же самих умовах, в яких вони можуть використовуватися для розмноження в рідкому середовищі. Каллусов використовують для іннокулірованія колб Ерленмейера, що містять 200 мл середовища Мурашіге і Скуга, з додаванням нафтіпуксусной кислоти і 6- (, -діметіламіно) -пуріна, вітамінів Лінсмейера і Скуга і 3% сахарози в якості джерела вуглецю. Колби инкубируют з перемішуванням на безперервному світлі протягом 4 днів, після чого біомасу клітин збирають для екстракції гликопротеинов.
приклад 2
Отримання гликопротеинов з клітин Gingko biloba
5 л культури, отриманої згідно з прикладом 1, центрифугують при низькій швидкості і зібрані клітини (1,5 кг сирого ваги) екстрагують 1,5 л 70% -ного етанолу, що містить 1% -ную сірчану кислоту. Екстракцію повторюють двічі, отримуючи тим самим кількісно основні глікопротеїни. Після нейтралізації екстракти фільтрують для видалення каламуті і концентрують у вакуумі при 50 o C до повного видалення етанолу. Водний концентрат нагрівають при 85 o C протягом 30 хв і центрифугують знову для видалення осаду, який відкидають. Отриманий прозорий розчин ультрафільтри з використанням мембрани Centricon R з кордоном відсікання 40000 Дальтон для виключення речовин з високими молекулярними масами.
приклад 4
Косметична препаративная форма
100 г емульсії олії у воді містить, г:
Розчин прикладу 2 або 3 - 10,0
Ацетильований ланоліновий спирт PEG-10 - 2,0
Цетиловий-стеаріловий спирт - 1,5
Цетилпальмітат - 2,0
Стеаринову кислоту - 7,0
Октілоктаноат - 7,5
Цетилфосфат калію - 0,5
Консерванти - За необхідності
Ароматизатор - За необхідності
Очищену воду - Скільки необхідно до 100
приклад 5
Косметична препаративная форма
100 г емульсії олії у воді містить, г:
Розчин прикладу 2 або 3 - 10,0
Цетілстеарілглюкозід - 5,0
Масло жожоба - 10,0
Ізопропілміристат - 8,0
Диметикон - 0,5
Антиоксидант - За необхідності
Консерванти - За необхідності
Ароматизатор - За необхідності
Очищену воду - В кількості необхідній до 100
Додаткові експериментальні дані.
приклад 6
Косметична препаративная форма
Розчин у воді, г:
Розчин суміші прикладу 2 або 3 - 2,00
Імідазолідінілмочевіна - 0,30
Метилпарабен - 0,20
Гідроксиетилцелюлоза - 2,00
приклад 7
Косметична препаративная форма
Гель, г:
Розчин суміші прикладу 2 або 3 - 1,00
Пропіленгліколь, діазолідінілмочевіна, метилпарабен, пропілпарабен - 1,00
Очищена вода - За необхідності до 100 МЛТ
2. Косметичний препарат для гідратації шкіри, до складу якого як активного агента суміш гликопротеинов по п.1.
3. Косметичний препарат по п.2 в форму водного спрею, лосьйону, розчину, емульсії, гелю, мазі, креми.