дослідження крові
Цитохімічні дослідження лейкоцитів
Цитохімічні дослідження займають важливе місце в диференціальної діагностики гемобластозів. Крім великого теоретичного значення, незаперечна їх роль в уточненні різних форм лейкозів. Розробка ефективних методів диференціальної діагностики і терапії гострих лейкозів, особливо гострого лімфобластного лейкозу дітей, стала можливою тільки після введення в клінічну практику цитохимических методів діагностики.
Цитохімічні дослідження проводять в мазках крові, лейкоконцентрате, кісткового мозку. Вони засновані на використанні специфічних хімічних колірних реакцій для визначення в клітинах різних речовин. При цитохімічним дослідженні користуються полуколичественной оцінкою результатів, використовуючи принцип G. Astaldi (1957), заснований на виявленні специфічного забарвлення різного ступеня інтенсивності. Залежно від неї досліджувані елементи ділять на чотири групи: з негативною реакцією (-), слабоположительной (+), позитивною (++) і резкоположітельних (+++).
Для кількісного вираження результатів підраховують 100 клітин певного виду і диференціюють їх за вказаним принципом, потім число клітин з однаковою інтенсивністю забарвлення множать на відповідне даній групі число плюсів, сума цих творів становить умовні одиниці (од.). Активність ферментів виражають в умовних одиницях або у вигляді середнього цитохимического коефіцієнта (СЦК). Середній цитохимический коефіцієнт обчислюють за формулою Кеплоу в модифікації Астальдо і Верга:
де цифри (1, 2, 3, 4) позначають інтенсивність забарвлення; букви (а, б, в, г) - число підрахованих клітин з певною інтенсивністю забарвлення (цитохімічної реакції).
Метод полуколичественной оцінки є орієнтовними, але дозволяє порівняти розподіл досліджуваних речовин в різних клітинних елементах або в одних і тих же клітинах при тих чи інших патологічних станах. Слід, однак, мати на увазі, що цитохимический метод може використовуватися тільки як доповнення до інших методів дослідження - морфологічним, імунологічним, цитогенетичним.
За рахунок глікогену в основному забезпечуються енергетичні потреби клітин. Зокрема, за рахунок реакцій глікогенолізу утворюється енергія, необхідна для здійснення функції фагоцитозу. Локалізується глікоген в цитоплазмі клітин. Для цитохимического виявлення глікогену найчастіше застосовують PAS-реакцію, або ШИК-реакцію (за назвою реактиву - Шифф-йодна кислота).
Позитивну ШИК-реакцію можуть також давати такі речовини, як глікозаміноглікани, мукополісахариди, глікопротеїни, мукопротеі-ни та ін. Глікоген можна легко диференціювати від інших речовин пробами зі слиною чи α-амілазою.
Проба зі слиною. Препарат поміщають в свіжозібраної слині в термостат при 37 ° С на 30 хв, потім його забарвлюють вищеописаної методикою. При інкубації препарату αамілаза, що міститься в слині, розщеплює глікоген, і при реакції з реактивом Шиффа рожеве забарвлення на глікоген не розвивається '.
Проба з α-амілазою. Препарат поміщають в розчин α-амілази (1 мл профільтрованої амілази розчиняють в 40 мл 0,85% розчину натрію хлориду) на 30 хв в термостат при 37 ° С.
Нормальні величини. У мазках периферичної крові і кісткового мозку глікоген міститься в цитоплазмі нейтрофілів різного ступеня зрілості, але переважно в більш зрілих (у вигляді рясної дрібної і дифузійної зернистості). У цитоплазмі мегакаріоцитів і тромбоцитів глікоген визначається у вигляді одиночних великих зерен. У крові здорових людей кількість інтенсивно забарвлених нейтрофілів (+++) коливається в межах 2-12% від загального числа нейтрофілів, середньої інтенсивності забарвлення (++) - в межах 72-90%, слабо забарвлених (+) - від 4 до 18 %. СЦК глікогену в нейтрофілах здорових людей дорівнює 1,71-2,04 (Кост Е. А. 1975), а за даними В. Б. Лецьки (1970) - 2,52. У осіб похилого та старечого віку відзначено достовірне зниження СЦК глікогену до 1,98 (Германов В. А. Сергєєва Т. М. 1972).
У лімфоцитах здорових людей глікоген міститься у вигляді невеликого числа гранул в 10-12% клітин. У мегакаріоцитів глікоген виявляється у вигляді гранул (від одиничних до 30-50), нагадуючи скупчення кров'яних пластинок. Число глікогенположітельних мегакариоцитов становить в середньому 60% від загального числа мегакаріоцитів.
Клінічне значення. Збільшення числа глікогенположітельних лімфоцітов4 (до 70-80%) характерно для лімфопроліферативних захворювань, особливо для хронічного лімфолейкозу (глікоген визначається у вигляді великих гранул). Збільшення вмісту глікогену в нейтрофілах спостерігається при різних запальних процесах, цукровому діабеті, справжній поліцитемії. Зменшення відзначається при агранулоцитоз, променевої хвороби, при хронічному мієлолейкозі - приблизно в 2 рази в порівнянні з нормою, особливо при прогресуванні захворювання (загальна кількість глікогену, яке визначається біохімічними методами, може бути навіть підвищений через лейкоцитозу). При тромбоцитопенічна пурпура та симптоматичних тромбоцитопеніях число глікогенположітельних форм мегакаріоцитів значно знижений (після спленектомії воно відновлюється до нормальних величин).
У лейкемических клітинах при гострому мієлобластний лейкоз глікоген або не міститься взагалі, або розподілений дифузно або у вигляді дрібної зернистості; при гострому лімфобластний лейкоз - у вигляді великих гранул, розташованих в цитоплазмі навколо ядра; при гострому монобластний лейкозі бластні клітини містять незначну кількість дифузно окрашиваемого глікогену; при гострому еритромієлоз глікоген у вигляді гранул виявляється в еритробластах.
Ліпіди локалізуються в цитоплазмі клітин, головним чином, в мембранах органел і виявляються переважно в нейтрофільних гранулоцитах. Відіграють важливу роль в проникності мембран. Клітини кісткового мозку та периферичної крові містять прості ліпіди у вигляді нейтральних жирів, вільних жирних кислот, а також складні ліпіди - фосфоліпіди. Цитохимические дослідження засноване на застосуванні речовин, що розчиняються в жирах (судан III, судан IV, чорний судан і ін.). Для виявлення нейтрального жиру застосовують судан III, що забарвлює жир в помаранчевий колір. Ліпоїдами краще виявляються Суданом чорним (чорне забарвлення). У гематологічних дослідженнях частіше застосовується забарвлення мазків Суданом III.
Див. Методики забарвлення:
Клінічне значення. Підвищення СЦК ліпідів відзначено в осіб старечого віку. Підвищення вмісту ліпідів в нейтрофілах спостерігається при гострому мієлобластний і монобластний лейкозі, при прогресуванні хронічного мієлолейкозу. При недиференційованому гострому лейкозі бластні клітини містять ліпіди в невеликій кількості (2-3%). Зменшення СЦК ліпідів відзначено при лікувальному голодуванні. Зниження вмісту ліпідів в нейтрофілах виявлено при ревматизмі, запальних процесах. При гострий лімфобластний лейкоз ліпіди в бластних клітинах не встановлені.
Пероксидаза (мієлопероксидаза)
В організмі людини пероксидаза виявлена в лейкоцитах, тромбоцитах, в молоці, а також в тканинах, в яких відбувається метаболізм ейкозан-идов. Простетичної групою є Протоген. В реакції, що каталізується пероксидазою, перекис водню відновлюється за рахунок з'єднань, які виступають в якості донорів електронів, таких як аскорбат, хінони або цитохром С. Реакція, що каталізується пероксидазою, має складний характер і сумарно виглядає наступним чином:
Пероксидаза локалізується переважно в специфічної зернистості цитоплазми гранулоцитів, є маркером клітин мієлоїдної природи. Вона відсутня в лімфоїдних клітинах. З огляду на специфічності для нейтрофілів, починаючи з ранніх фаз дозрівання, фермент отримав назву мієлопероксидаза. Активність пероксидази схильна до великих коливань.
Див. Методики забарвлення:
Нормальні величини. У крові здорових людей активність пероксидази виявляється переважно в цитоплазмі гранулоцитів, в меншій мірі і не постійно - моноцитів. Фермент з'являється в клітинах на стадіях проміелоціти і більш зрілих мієлобластів. Лімфобласти не містять пероксидазу. 3-16% нейтрофілів пофарбовані різко позитивно (+++), 60-90% - позитивно (++), решта - слабопозитивний (+) (Кост Е. А. 1975). СЦК пероксидази в нейтрофілах здорових людей дорівнює 2,5 (Лецко В. Б. 1970). Еозинофіли характеризуються різко позитивною реакцією на пероксидазу.
Клінічне значення. В бластних клітинах висока активність ферменту при гострому мієлобластний лейкоз. У хворих з на хронічний мієлолейкоз, особливо в термінальній стадії, СЦК знижується до 1,6; слабка активність ферменту спостерігається при гострому монобластний лейкозі і відсутня при гострому лімфобластний лейкоз. Визначення активності мієлопероксидази як маркера мієлоїдного ряду використовується для диференціальної діагностики гострих мієлобластних і лімфобластних лейкозів. Зниження активності ферменту відзначено при інфаркті міокарда, ревматизмі, туберкульозі, пухлинах.
лужна фосфатаза
Активність лужної фосфатази виявляється вперше на стадії метамієлоцити, підвищується в міру диференціювання до сегментоядерних нейтрофіла, а потім у міру старіння клітини знову знижується. Активність ферменту визначається в специфічних гранулах цитоплазми. Лужна фосфатаза відноситься до групи гидролитических ферментів, розщеплює різні фосфорні ефіри в лужному середовищі (оптимум pH 9,6), здійснює гідроліз однозамегценних ефірів ортофосфата. Найбільш поширене визначення активності ферменту методами азосочетанія.
Див. Методики забарвлення:
Клінічне значення. Підвищення активності ферменту в цитоплазмі нейтрофілів відзначається при справжній поліцитемії, хронічному мієлофіброзі, апластична анемія. Збільшення активності лужної фосфатази в цитоплазмі нейтрофілів при гострих нелімфобластних лейкозі - сприятлива ознака, оскільки у таких хворих більш вірогідні ремісії. Збільшення активності ферменту виявлено у дітей першого півріччя життя-150-159 од. Активність ферменту збільшується при вагітності, при багатьох запальних процесах, хронічних захворюваннях печінки, інфекціях, злоякісних новоутвореннях, діабетичному кетоацидозі, прийомі пероральних контрацептивів, хвороби Дауна, інфаркті міокарда та ін. Різке зниження активності лужної фосфатази (до повної відсутності) спостерігається при хронічному мієлолейкозі, що може служити важливим доповненням диференціальної діагностики хронічного мієлолейкозу і хронічного миелофиброза, а також лейкемоідних реакцій по м іелоідному типу. Зниження активності ферменту спостерігається при вірусних захворюваннях, в тому числі інфекційному гепатиті, при променевої хвороби, серповидно-клітинної анемії, хворобах сполучної тканини.
кисла фосфатаза
Активність кислої фосфатази виявляється переважно в нейтрофілах і лімфоцитах крові (максимально в нейтрофільних мієлоцитів); локалізацію пов'язують з лізосомами цитоплазми клітин. Кисла фосфатаза є гидролитическим ферментом (оптимум дії при pH 5,2). Для цитохимического дослідження зазвичай використовують методи азосочетанія. Нафтолфосфати під впливом кислої фосфатази розщеплюються з утворенням вільного нафтола, який вступає в реакцію з сіллю діазонію. В результаті в місцях визначається активності ферменту випадає осад азокрасителя червоного кольору на зеленому тлі.
Див. Методики забарвлення:
Нормальні величини. У клітинах крові активність ферменту виявляється в 12% зрілих гранулоцитів і в лімфоцитах. У нейтрофілах периферичної крові здорових людей активність ферменту коливається в межах 11-72 од. т. е. СЦК дорівнює 0,386; в лімфоцітах- 25,0-28,8 од. т. е. СЦК дорівнює 0,286. У дітей активність кислої фосфатази в нейтрофілах вище, ніж у дорослих.
Клінічне значення. Активність кислої фосфатази підвищується при гострих лейкозах - монобластний і миелобластном, особливо при гострому промієлоцитарному лейкозі (в дифузній формі), при гострих лімфобластний лейкозі (в гранулярной формі). Підвищення активності ферменту спостерігається в нейтрофілах при запальних процесах (гостра пневмонія), туберкульозі, інфаркті міокарда, гострих хірургічних інфекціях, злоякісних пухлинах. Підвищення активності ферменту в лімфоцитах відзначається при хронічних тонзилітах, при різних алергічних захворюваннях, після імунізації.
неспецифічні естерази
Неспецифічні естерази - це група ферментів (гідролаз) з невисокою специфічністю, що розщеплюють ефіри карбонових кислот з коротким вуглецевим ланцюгом. Локалізуються в цитоплазмі клітин, головним чином, в лізо-сомах. Активність цих ферментів в тій чи іншій мірі виявляється у всіх видах лейкоцитів (максимально в незрілих гранулоцитах і моноцитах). Найбільша активність виявлена в моноцитах крові. Для визначення активності ферментів використовують різні субстрати (α-нафтілацетат, нафтол-AS-ацетат, нафтол-AS-D-хлорацетат і ін.). Під впливом неспецифічних естераз з субстрату звільняється вільний нафтол, який дає кольорове забарвлення з солями діазонію.
дегідрогенази
Дегідрогенази - ферменти, що каталізують окислювально-відновні реакції за участю двох субстратів. Ряд з них бере безпосередню участь в процесах біологічного окислення, здійснюючи перенесення протонів з субстрату, що піддається окисленню, на інший субстрат. Дегідрогенази, що каталізують таке відновлення, специфічні як до донору водню, так і до його акцептору. Дегідрогенази присутні в самих різних клітинах і тканинах. Вони локалізуються в цитоплазмі і мітохондріях, можуть бути виявлені цитохімічно при експозиції клітин з відповідним субстратом, на який дегідрогенази діють в присутності тетразоліевих з'єднань, здатних акцептувати протони, з утворенням нерозчинних забарвлених сполук.
Нормальні величини. У здорових людей СДГ і α-ГФДГ виявляються у вигляді гранул синього кольору в нейтрофілах, лімфоцитах, тромбоцитах периферійної крові і мієлобластів, гранулоцитах, мегакаріоцитів, еритро-і нормобластів кісткового мозку.
СЦК СДГ лімфоцитів становить 1,10 ± 0,05; α-ГФДГ - 0,80 ± 0,08. У дітей активність СДГ виявляється в 46% лімфоцитів. У дорослих в пунктаті кісткового мозку 88% недиференційованих клітин мають активність ферменту (+), все ядерні клітини еритроїдного ряду і гранулоцити проявляють активність на (+) або (++).
Клінічне значення. Підвищення активності СДГ і α-ГФДГ в гранулоцитах виявлено у хворих із злоякісними пухлинами. Зниження активності виявляється в лімфоцитах в період нападу бронхіальної астми, при хронічному лімфолейкозі, в гранулоцитах - при хронічному мієлолейкозі.