Останні досягнення генної інженерії і біотехнології привели до бурхливого розвитку абсолютно нового напрямку вакцинологии - до ДНК-вакцин.
Основою ДНК-вакцини є бактеріальна плазмида (автономна кільцева ДНК з 4-6 тис. Пар нуклеотидів), здатна ефективно розмножуватися в клітинах Е. coli. У плазмиду генно-інженерними методами (використовуючи ферменти рестріктази, лігази і т. Д.) Вбудовують «смисловий» ген, що кодує імуногенний білок того вірусу, від якого буде захищати ДНК-вакцина. На практиці в якості вихідної плазміди використовують модифіковану плазмиду, що містить еукаріотичний промотор (забезпечує високий рівень експресії генів) цитомегаловірусу або мавпячого вірусу 40, або вірусу саркоми Рауса, і сигнали термінації транскрипції і поліаденілювання, що дозволяють продукувати імуногенний білок вірусу в клітинах тварин. Крім того, в плазмиде є ген стійкості до антибіотика (наприклад, до ампіциліну), необхідного для її селекції при клонуванні і вирощуванні.
Таким чином отримують рекомбинантную плазмиду, яку вирощують (реплікують) в необхідних кількостях в бактеріальних клітинах Е. coli в присутності ампіциліну і після відповідного очищення плазміди використовують для імунізації тварин. Зазвичай використовують фізіологічний розчин, в якому в підвішеному стані знаходяться отримані плазміди (це знімає проблему реактогенності препарату).
Результати дослідження на лабораторних тваринах показали, що кількість рекомбінантної плазміди, необхідної для вакцинації при внутрішньом'язовому введенні, може коливатися в межах 0,001 - 10 мкг на 1 кг живої маси.
Плазмідна ДНК поглинається клітинами тварин в невеликій кількості (0,01 - 1,0%), а більша частина її швидко руйнується.
Проникла в клітку ДНК транспортується в ядро і транскрибується (клітинної ДНК-залежної PHK-полімеразою II) з утворенням мРНК, яка в цитоплазмі на рибосомах клітини забезпечує синтез повноцінного імуногенною білка збудника, що призводить до утворення гуморального і клітинного імунної відповіді і, отже, до формування напруженого імунітету. Плазмідна ДНК функціонує в клітинах до 3-6 міс.
ДНК-вакцини можна вводити під шкіру, внутрішньом'язово, підшкірно, внутрішньовенно, інтраназально, орально. Найбільш перспективними вважають внутрішньошкірний і внутрішньом'язово методи. Заслуговують на увагу результати по так званому балістичному методу введення (gene gun), коли частинки золота діаметром 1-2 мкм, покриті плазмідної ДНК, за допомогою спеціального приладу доставляють в клітини шкіри. Для отримання однакового ефекту потрібно ДНК в 100-5000 разів менше, ніж при внутрішньом'язовому способі введення.
Механізм імунної відповіді при ДНК-вакцинації поки не зовсім зрозумілий. Однак наявні дані дозволяють припустити, що це виглядає наступним чином. Синтезований в клітинах білок розщеплюється в плазматичних протеосомах на короткі пептиди (8-16 амінокислот), що представляють собою окремі епітопи або антигенні детермінанти. Пептиди транспортуються білками-переносниками в ендоплазматичнийретикулум. Там вони зв'язуються з молекулами білків головного комплексу гістосумісності класу I (ГКГС I) - мембранними гликопротеидами і транспортуються на поверхню клітин, де розпізнаються цитотоксичними Т-лімфоцитами. Останні активуються, розмножуються, і утворюється пул цитотоксичних Т-лімфоцитів, здатних забезпечити загибель клітин-мішеней, т. Е. Клітин, заражених вірусом.
Синтезований в клітинах імуногенний білок може транспортуватися з клітки в міжклітинний простір. Він зв'язується з антигенпрезентуючими клітинами (макрофагами), проникає в них шляхом ендоцитозу, розщеплюється на короткі фрагменти (10-20 амінокислот) білка, які об'єднуються з молекулами ГКГС класу II і транспортуються до поверхні клітини, де вони впізнаються відповідними клонами Т-хелперів і В клітин, що призводить до активації в-клітин і диференціювання їх в плазматичні клітини, що секретують антитіла. Дія цитотоксичних Т-лімфоцитів також стимулюється Т-хелперами за допомогою продукції ними цитокінів - медіаторів міжклітинних взаємодій.
Таким чином, плазмідна ДНК з вбудованим геном імуногенною білка вірусу індукує у тварин повноцінний гуморальний і клітинний імунну відповідь.
Для посилення імуногенних властивостей ДНК-вакцин їх вводять спільно з плазмідами, в які вбудовані гени цитокінів (регулятори імунної відповіді). Крім того, введення ДНК-вакцин в ліпосоми або в мікрокапсулах забезпечує високий рівень гуморального і клітинного імунної відповіді.
В даний час сконструйовано більш 20 ДНК-вакцин проти різних вірусних хвороб тварин і людини: сказу, хвороби Ауєскі, хвороби Ньюкасла, інфекційного ринотрахеїту, вірусної діареї, лейкозу великої рогатої худоби, ринопневмонії коней, синдрому зниження несучості, парвовирусной інфекції собак, СНІДу, герпесвірусних інфекцій людини та ін.
ДНК-вакцини найбільш перспективні для профілактики хвороб, схильних до тривалого хронічного перебігу. Вони володіють безпекою інактивованих і ефективністю живих вакцин. Однак поки немає повних відомостей про те, яка ефективність ДНК-вакцин при імунізації ними людей. Всесвітня організація охорони здоров'я (ВООЗ) розробила уніфіковані вимоги до ДНК-вакцин. Ефективність імунізації ДНК-вакцинами очевидна, проте технологія розробки цих вакцин знаходиться в стадії становлення і інтенсивного вивчення. Буде потрібно ще чимало зусиль для практичної реалізації нового підходу до профілактики вірусних хвороб тварин і людини.
Примітка. Реплікація плазмідної ДНК відбувається тільки в бактеріальних клітинах, тоді як транскрипція гена імуногенною білка здійснюється тільки в клітинах ссавців. Досліди на тваринах показали, що плазмідна ДНК не реплицируется, не вбудовується в хромосоми і на неї не утворюється антитіл в організмі тварин.
Поділіться посиланням з друзями