Експрес-діагностика холери. Холеру викликають два биовара Vibrio cholerae. Один з них, виділений Кохом в Єгипті в 1883 році, назвали класичним, інший, отриманий Ф.Готшліхом на карантинній станції Ель-Тор в Північній Африці в 1906 році V.eltor. обидва биовара неагглютінірующіеся вібріони Нагі, галофільні парагемолітічеських вібріони, які продукують гемолізини, і нехолерной вібріони-кислотоутворювачами включені в рід Vibrio сімейства Vibrionaceae.
Це гостра кишкова інфекція, що супроводжується різким зневодненням і обессоливанием організму. Джерелом інфекції є людина хвора або носій. Механізм передачі фекально-оральний. Збудники мають соматичний О-і жгутикових Н-антигени.
О-антиген має видовий і типовий специфічністю. За будовою О-антигену розрізняють довше 40 сероварів. Розвивається до холери імунітет носить гуморальний характер. Матеріал для дослідження випорожнення, блювотні маси, трупний матеріал. Метод масового дослідження на вибриононосительство. Матеріал береться безпосередньо з кишечника за допомогою скляної трубочки діаметром 0,5 см для дітей, 1,5 см для дорослих і довжиною 15 см з оплавленими кінцями при відсутності трубочок використовують ватні тампони на дерев'яних паличках.
Трубочку негайно занурюють у флакон, що містить 100 200 мл 1 пептонною води і агглютинируют холерну О-сироватку в розведенні до половини її титру. В один і той же флакон беруть матеріал від 10 осіб. Флакони поміщають в термостат при 370С. Через 3 4 години холерні вібріони починають агглютинироваться і поступово в протягом найближчих 2 годин падають у вигляді пластівців на дно флакона. Досліджуючи під мікроскопом пофарбовані мазки і висячу краплю, виявляють склеєних і частково вільних вібріонів.
Через 6 годин дається відповідь і в разі виявлення холерних вібріонів негайно проводиться посів індивідуально від кожного з 10 осіб. Такий метод дає можливість досліджувати до 16 000 чоловік за 3 4 дні. Метод імунодіагностичних мікроплівку. Вивчення антигенних властивостей холерних вібріонів проводять шляхом постановки пробіркових або пластинчастої реакції аглютинації з використанням сухих ліофілізованих діагностичних аглютинативна холерних 0-сироваток і сироваток Огава і Інаба. Сироватку розводять у фізіологічному розчині або дистильованої води і змішують при постановці аглютинації на склі з досліджуваної культурою вібріонів.
При підготовці сироватки використовується додаткова посуд, що ускладнює роботу бактеріолога, а в що залишилася розведеною сироватці швидко проростає бактеріальна мікрофлора і інактивує її. Для вивчення антигенної структури холерних вібріонів були розроблений імунодіагностичних препарат у вигляді мікроплівок разового застосування, який володів достатньою специфічністю, демонстративністю і економічністю.
Іммунодіагностіческіе холерні мікроплівку ІХМП у вигляді полімерної плівки з нанесеними висушеними краплями, фіксованими на папері, містять мінімальну кількість сироватки, плівкоутворювальний компонент і консервант. Плівкоутворюючий компонент пов'язує, склеює і фіксує микроколичества інгредієнтів до поверхні носія, виключає крошение мікроплівок консервант охороняє препарат від руйнування при тривалому зберіганні.
Концентрація діагностичної сироватки в ІХМП є достатньою, оскільки після емульгування у краплі фізіологічного розчину, антитіла містяться в титрі 1100, що повністю забезпечує хід реакції. Тим самим забезпечується достатня концентрація антитіл, знижується, витрата діагностичної сироватки і виключається можливість її невикористання. При цьому створюються умови для швидкого розчинення ІХМП, контакту її з холерним вібріоном і проведення реакції безпосередньо на полімерній плівці.
Готові ІХМП зберігають в темному сухому місці при 4 7С в картонних коробках термін придатності 3 роки термін спостереження і при необхідності ІХМП використовують для визначення холерних вібріонів. Для виключення випадкового зараження навколишніх предметів ІХМП поміщають в чисту чашку Петрі. На поверхню ІХМП наносять краплю фізіологічного розчину, в якій розчиняють її. Розведену сироватку змішують з досліджуваної культурою вібріонів, знятої бактеріологічної петлею з живильного середовища.
При іншому варіанті постановки реакції ІХМП знімають скальпелем з паперової підкладки і переносять на предметне скло, розчиняють в краплі фізіологічного розчину і змішують з досліджуваної культурою вібріонів. При позитивній реакції через 1 3 хв з'являються зерна агглютіната, пофарбовані в зелений колір, а крапля просвітлюють. При негативній реакції крапля залишається гомогенно-каламутній. Використану частина полімерної плівки відрізають, а частину, що залишилася плівки з ІХМП зберігають в тій же чашці Петрі для подальших досліджень.
Використання ІХМП в дослідженнях вібріонів та інших мікроорганізмів дозволяє отримати статистично достовірні результати, заощадити дорогі діагностичні сироватки, підвищити якість і ефективність досліджень. Реакція аглютинації мікрометодом. Останнім часом у бактеріологічній практиці знайшов досить широке застосування мікрооб'ємні метод постановки серологічних реакцій з використанням спеціальних планшеток і мікротітровальних голок. Реакції аглютинації мікрометодом ставлять з холерними аглютинативна референс-сироватками в полістролових мікротітровальних планшетка з плоским або V-образ-ним дном, призначених для імунологічних реакцій, використовуються мпкротітровальние планшетки з об'ємом лунок 0,4 мл і в пробірках паралельно.
Попередньо планшетки ретельно промивfют проточною водою, кожну лунку полоскати дистильованою водою і добре просушивали, потім робили написи простим олівцем.
У всі лунки чотирьох рядів піпеткою-крапельницею з мікротитратор Такач вносять 0,85 розчин хлористого натрію рН 7,2 в обсязі 0,05 мл, потім в першу лунку кожного ряду того ж обсягу відповідної сироватки в розведенні 125 і проводять її титрації мікротітроваль-ної голкою з головкою обсяг 0,05 мл, видаляючи з останньої лунки по 0,05 мл. Після титрации сироваток в усі лунки, крім їх контролів, вносять 0,05 мл суспензії досліджуваної агарної культури.
Цю маніпуляцію проводять на підносі. Після закінчення титрации планшет накривають кришкою і ставлять на підносі в термостат при 37 С. Після 2-годинної експозиції проводять остаточний облік реакції під стереомикроскопом МБС-1, МБС-2 в косопроходящем світлі. При обліку реакції кришку з планшетки не знімають, в разі її запотівання замінюють на іншу. Після обліку реакції планшетку і кришку складають в кювет і заливають 5 хлорамином так, щоб всі лунки планшетки були заповнені дезрозчином.
Дослідження показали, що всі холерні вібріони класичного і ельтор биоваров агглютинируются холерної видовий 0-сироваткою в мікрооб'ємах. Що стосується агглютінабельності типоспецифічними сироватками, то простежується наступна закономірність при постановці з сироваткою Інаба в мікрометодом агглютініровалісь 100, а в пробірках 90 штамів класичного холерного вібріона серовара Інаба. Холерні вібріони биовара ельтор серовара Інаба агглютініровалісь в планшетка і пробірках відповідно в 95 і 96 випадків.
У холерних вібріонів класичного і ельтор биоваров серовара Огава співвідношення в обох методиках були практично ті ж. Цікавий факт, що при постановці реакції аглютинації з RO-сироваткою найбільше число штамів, аглютинативна RO-сироваткою до титру, було виявлено в мікрометодом в пробірках аглютинація встановлена в одного штаму. Всі штами вібріонів 040 056 сероварів в мікрометодом НЕ агглютініровалісь холерними аглютинативна сироватками, а в пробірках штам II 258-1099 040 серовара агглютініровалісь усіма холерними сироватками.
Більшість вивчених штамів представників сімейства Enterobacteraceae теж агглютініровалісь холерними аглютинативна сироватками, за винятком Sh. flexneri 2503, у якого в пробірках була виявлена аглютинація з усіма сироватками, і штаму S. typhimurium 21, у якого відзначена неспецифічна реакція аглютинації з усіма сироватками як в пробірках, так і в планшетка.
При користуванні цим методом витрата аглютинативна сироваток зменшується в 10 разів, значно скорочується час, необхідний для постановки реакції, і прискорюється термін видачі відповіді. Крім того, описаний метод менш трудомісткий. Таким чином, стандартність, достовірність отриманих результатів, висока економічність методу дозволяють рекомендувати його при ідентифікації холерних вібріонів, вивченні штамів і популяції штамів холерних вібріонів за ознакою агглютінабельності.
А також Іммобілізація вібріонів холерними сироватками і типовими холерними фагами. Краплі випорожнень або матеріалу з поверхні пептонов води обробляють холерної О-сироваткою, типовими сироватками Огава та Інаба або типовими холерними фагами. Готують з них препарати роздавлена крапля, які досліджують за допомогою темнопольной і фазовоконтрастной мікроскопії. У позитивному випадку через 3-5 хвилин рух вібріонів припиняється. РИФ. Препарати з досліджуваного матеріалу обробляють флюоресцирующей протихолерної сироваткою і досліджують в люмінесцентному мікроскопі.
Позитивним результатом вважається виявлення в препараті навіть одиничних вібріонів з яскравим жовто-зеленим світінням у вигляді блискучого обідка по периферії клітини. Позитивний результат можна отримати через 1-2 години після початку дослідження при концентрації вібріонів не менше 106 клітин в 1 мл тому рекомендується попередньо підрощування матеріалу на поживних середовищах.