Обробка і фарбування кісткової тканини
для гістологічних досліджень.
Перш ніж приступити до декальцінаціі, кістка, як і будь-яку тканину, необхідно піддати фіксації. Вибір фіксатора залежить від цілей і характеру дослідження. Так, для бешкетних препаратів і виявлення фібрилярних компонентів кісткової тканини застосовують чистий формалін (15-20% Розчин), в той час як для цитологічних досліджень краще складні фіксатори, також містять формалін, бо він зменшує ступінь набухання волокнистих структур, при подальшій обробці тканини ( наприклад. фіксатор Штіве: насичений водний розчин дихлорида ртуті - 76мл, формалін 20 мл, крижана оцтова кислота-4 мл)
Для фіксації слід випилювати лобзиком невеликі шматочки кістки (товщиною 0.5-1 см), так як через високу щільності тканини фіксатор проникає повільно. Термін фіксації залежить від товщини шматочка (не менше 48 годин)
При закінченні фіксації об'єкт ретельно промивають в проточній водопровідній воді або спирті (наприклад, після складних фіксаторів, що містять дихлорид ртуті), так як при подальшій обробці кислотами можуть утворитися важкорозчинні опади. Після цього з метою знежирення препарату проводять через ряд спиртів підвищується концентрації (50, 70 і 96%), а потім доводять до води через спирти низхідній концентрації.
Декальцинація досягається обробкою кісткової тканини за допомогою декальцінуючі рідин, що володіють властивостями розчиняти неорганічні солі, не пошкоджуючи структурні елементи кістки.
При декальцінаціі слід дотримуватися наступних основних правил:
1. Застосовувати велика кількість декальцінуючі рідини і змінювати її щодня (обсяг рідини повинен перевищувати обсяг об'єкта не менше ніж в 50-70 разів);
2. Декальцініруемий об'єкт поміщати в верхнім шарі рідини, щоб забезпечити опускання на дно розчиняються солей (підвішування шматочків на нитці або скляному ситі);
3. Проводити декальцинацію до повного видалення мінеральних солей (але не перетримувати матеріал в рідинах, так як це призводить до набухання фібрил і погіршення окрашиваемости структур)
Декальцинація вважається повною тоді, коли об'єкт стає м'яким і ріжеться ножем легко і без хрускоту. Хід процесу можна перевірити за ступенем занурення в об'єкт препаровальной голки. Згинати препарат і натискати на нього не рекомендується, так як це призводить до пошкодження тонких структур кістки.
Декальцинація в в одному розчині АЗОТНОЇ КИСЛОТИ (5-7,5%) є найбільш поширеним способом. Для приготування робочого розчину в мірну колбу наливають 5-7,5 мл хімічно чистої концентрованої азотної кислоти (щільність 1,40) і доливають до 100 мл дистильованої води (розчин можна готувати про запас у великих кількостях, розрахувавши загальну потребу). Застосовувати більш низькі і більш високі концентрації розчинів для декальцінаціі кістки не рекомендується, так як перші викликають набухання, а другі пошкодження клітинних структур. Більш високі концентрації (до 10%) використовують лише для декальцінаціі зубів.
Налив потрібну кількість рідини в відповідний скляну посудину, в неї підвішують підготовлений до декальцінаціі шматочок кістки. Розчин змінюють щодня до настання повної декальцінаціі. Термін декальцінаціі залежить від властивостей об'єкта (щільність, величина) і концентрація азотної кислоти. Середня тривалість декальцінаціі невеликих шматочків компактної кісткової тканини 10-12 діб.
Після закінчення декальцінаціі для усунення набухання волокнистих структур препарат підвішують на 24 години в 5% розчин СУЛЬФАТУ НАТРІЮ Na2SO4 або ЛІТІЮ Li2SO4 (в разі відсутності таких солей кістка слід помістити в 96% спирт) і лише після цього ретельно промивають протягом 1-2 діб в проточній водопровідній воді.
Можна скоротити термін отримання декальцінірованний кістки, помістивши випиляний шматочок безпосередньо в 5% розчин трихлороцтової кислоти, що містить 10-20% формаліну. Ця суміш одночасно фіксує і декальцінуючі. Маленькі шматочок середньої щільності можна декальцінірованний за 3-5 днів. Після декальцінаціі після декальцінаціі промивають в спирті (НІВКОЕМ РАЗІ НЕ В ВОДІ.)
Існує ряд інших способів декальцінаціі, але всі вони засновані на одному і тому ж принципі і вимагають дотримання викладених вище загальних правил.
Після декальцінаціі кісткову тканину можна різати на заморожувати мікротому, а також заливати в целлоидин або целлоидин - парафін звичайним шляхом. Заливка в парафін не рекомендується, так як він погано просочує декальцінірованний кістка.
Найбільш поширений метод фарбування зрізів декальцінірованний кісткової тканини -по Шморля (ТІОНІНПІКРІНОВАЯ КИСЛОТА).
А- насичений розчин тіоніном в 50% спирті.
Б-1% водний розчин фенолу.
В- насичений розчин пікринової кислоти.
Перед вживанням зливають 1 частина розчину (А) з 10 частинами розчину (Б). Що знаходиться в воді зрізи переносять на 10 хв в отриману суміш, після чого споліскують в дистильованої воді і поміщають на 30-60 с в насичений розчин пікринової кислоти. Потім зрізи знову споліскують в дистильованої воді і диференціюють в 70% спирті до отримання темно-червоного забарвлення. Після цього їх переносять в 96% спирт, в якому продовжують диференціювання (під контролем мікроскопа до тих пір, поки загальний фон зрізу не набуде коричневий (або болотний) колір, а кісткові клітки і їх відростки - червоний. Пофарбовані зрізи потім проводять через 96% і абсолютний спирт, карбол - ксилол, ксилол і укладають в полістирол.
Якщо зрізи погано забарвлюється через тривалу декальцінаціі в азотній кислоті, його потрібно попередньо помістити на 2 3 ч в о, 5% аміачну воду, після чого добре промити, в дистильованої воді і потім пофарбувати.