Генна інженерія »Ферменти-рестріктази і рестрикция ДНК
В ході еволюції бактерії розвинули здатність синтезувати так звані рестріцірующіе ферменти (ендонуклеази), які стали частиною клітинної (бактеріальної) системи рестрикції-модифікації. У бактерій системи рестрикції-модифікації є внутрішньоклітинної імунною системою захисту від чужорідної ДНК. На відміну від вищих організмів, у яких розпізнання і руйнування вірусів, бактерій та інших патогенів відбувається внеклеточно, у бактерій захист від чужорідної ДНК (ДНК рослин і тварин, в організмі яких вони мешкають) відбувається внутрішньоклітинно, т. Е. Тоді, коли чужорідна ДНК проникає в цитоплазму бактерій. З метою захисту бактерії в ході еволюції розвинули також здатність «мітити» власну ДНК метіліруется підставами на певних послідовностях. З цієї причини чужорідна ДНК через відсутність в ній метальних груп на тих же послідовності плавиться (розрізається) на фрагменти різними бактеріальними рестріктазамі, а потім деградує бактеріальними екзонуклеаза до нуклео-тідов. Можна сказати, що таким чином бактерії захищають себе від ДНК рослин і тварин, в організмі яких вони мешкають тимчасово (як патогени) або постійно (як сапрофіти).
Рестріктази вперше були виділені з Е. coli в 1968 г-Виявилося, що вони здатні розрізати (плавити) молекули ДНК на різних сайтах (місцях) рестрикції. Ці ферменти отримали назву ендонуклеаз класу I. Потім у бактерій були виявлені ендонуклеази класу II, які розпізнають в чужорідної ДНК сайти рестрикції специфічно і на цих сайтах теж здійснюють рестрикцию. Саме ферменти цього класу стали використовувати в генної інженерії. Тоді ж були відкриті ферменти класу III, які плавлять ДНК поруч з сайтами розпізнання, але ці ферменти не мають значення в генній інженерії.
Дія системи рестрикції-модифікації «раціоналізуется» так званими паліндромний (розпізнають послідовностями) азотистих основ, які є сайтами рестрикції ДНК. Паліндромний послідовності - це послідовності підстав, які однаково читаються вперед і назад, як, наприклад, послідовність літер радар. Оскільки ланцюга ДНК мають антипаралельними напрямком, то вважають, що послідовність є паліндромний, якщо вона ідентична, коли читається в напрямку від 5'до 3'-кінця на верхній і 3'до о'-кінця на нижній ланцюга, а саме:
Паліндроми можуть бути будь-яких розмірів, але більшість тих палиндромов, які використовують в якості сайтів впізнавання рестріктазамі, складаються з 4, 5, 6 і рідше 8 підстав.
Рестріктази - це абсолютно необхідний інструмент в генній інженерії для вирізання цікавлять фрагментів (генів) з великих молекул ДНК. Оскільки відомо більше 100 ферментів рестрикції, то це дозволяє вибір рестриктаз і селективне вирізання фрагментів з вихідної ДНК.
Чудовою особливістю рестріктаа є те, що вони продукують розрізи молекул на декілька фрагментів (рестрік-тов) ДНК уступами, в результаті чого в утворюються кінцях одна ланцюг довша за іншу, утворюючи своєрідний хвіст. Такі кінці (хвости) отримали назву «липких» решт т. К. Вони здатні до самокомплементарності.
Розглянемо результати рестрикції на прикладі однієї з найбільш відомих рестриктаз Eco RI з системи рестрикция-модифікація Е. coli. Замість того, щоб плавити ДНК в центрі па-ліндромной послідовності впізнавання, цей фермент плавить ДНК за межами центру та продукує 4 самокомплементарних ( «липких») кінця, що складаються з різної кількості нуклео-тідов, а саме:
Ці «липкі» кінці в генно-інженерних дослідах корисні з тієї причини, що вони можуть бути возз'єднані комплементарно при низьких температурах, що дозволяє ефективне змикання ДНК-фрагментів.
Слідом за рестрикції ДНК з рестрикційних суміші виділяють рестрикційні ДНК-фрагменти (ДНК-рестрікти), які необхідні потім для об'єднання з вектором. Для виділення ДНК-рестріктов вдаються до електрофорезу, оскільки за допомогою цього методу рестрікцірованную ДНК дуже легко Фракціоновані завдяки розмірам фрагментів-рестріктов і завдяки сталою відносин електричний заряд-маса. Фрагменти в електричному полі мігрують в ході електрофорезу при частоті, залежною від їх розмірів (маси). Чим більше (довше) фрагмент, тим повільніше він мігрує в електричному полі. Матеріалом, в якому проводять електрофорез, є незаряжающіеся агар-за і поліакриламід. Для впізнання фрагментів використовують ці-дій бромід, який фарбує фрагменти, що веде до їх більш легкому виявленню
Рекомендуємо до прочитання:
Результати дослідження та їх обговорення. Реакції серцево-судинної системи юнаків і дівчат на стресові впливу в залежності від виду стресу та психоемоційного стану піддослідних
У дослідженнях на людях вивчали вплив стресів на ССС з використанням різноманітних стресових впливів, близьких до середовищним ситуацій і адекватних соціо-біологічними особливостями людини. Проведені дослідження дозволили вияви.
ліпіди
Особливий інтерес представляють ліпіди синьо-зелених водоростей. У формуванні фотосистеми, відповідальної за виділення кисню, значну, хоча ще не з'ясованих роль відіграють поліненасичені жирні кислоти, особливо L-лінолева. Однак не.