Методи клонування ДНК
Геномні бібліотеки, клонування ДНК in vivo
Після того, як ДНК зшита в пробірці, її необхідно розмножити.
Існує два підходи до клонування ДНК. Перший підхід передбачає використання бактеріальних або дріжджових клітин для розмноження введеної в них чужорідної ДНК. Другий спосіб є амплификацию ДНК in vitro.
Клонування ДНК in vivo
Використовуючи мікроорганізми, можна створювати два типи бібліотек ДНК: геномної і клонову (кДНК).
Геномна бібліотека. Якщо геном будь-якого організму розрізати, вставити в плазмідні або вірусні вектора і ввести в клітину, то в такому вигляді його можна зберегти. При розрізуванні плазмидной або фагової ДНК ймовірність випадання цілих і незмінених шматків генома досить висока.
Такий спосіб отримання геномної бібліотеки отримав назву «метод дробовика», так як геном в даному випадку представлений окремими фрагментами.
Принципи створення плазмідних та вірусних векторів загальні, тому розглянемо їх на прикладі плазмідних. Слід зазначити, що з вірусних ДНК краще використовувати ДНК фагів, так як вони мають велику ємність і дозволяють вставляти більші шматки генома.
Очищені кільцеві молекули ДНК обробляють рестриктазой, отримуючи лінійну ДНК. Клітинну ДНК обробляють тієї ж рестриктазой, додають до плазмидной, додають лігази. Таким чином отримують рекомбинантную плазмидную ДНК, яку вводять в бактеріальні або дріжджові клітини. Плазмида реплицируется з утворенням багатьох копій. Багато плазміди несуть ген стійкості до антибіотиків, і якщо в рекомбінантної плазміди є такий ген, то клітини легко виявляти, вирощуючи на середовищі з антибіотиком.
Кожна така колонія являє собою клон або потомство однієї клітини. Плазміди однієї колонії містять клон геномної ДНК, а сукупність плазмід можна назвати бібліотекою геномної ДНК. Недолік такого методу в тому, що фрагменти ДНК утворюються у величезній кількості. Розрізання геномної ДНК визначається випадком, тому лише частина фрагментів містять повноцінні гени. Деякі фрагменти можуть містити тільки частина гена або ж Інтрони послідовності.
Бібліотека кДНК. Створення кДНК починається з синтезу на матриці РНК за допомогою зворотної транскриптази комплементарної нитки ДНК. Потім створюють лужні умови, руйнують ланцюг РНК на нуклеотиди, після чого за допомогою ДНК-полімерази синтезують комплементарних ланцюг ДНК. При цьому утворюється фрагмент ДНК з тупими кінцями. Таку ДНК вбудовують в плазміди і вводять в клітини бактерій. При ампліфікації плазміди утворюється клон комплементарної копії ДНК (кДНК).
Переваги клоновій ДНК перед клонами геномної ДНК в тому, що кодує білок нуклеотидних послідовність гена нічим не переривається.
Гени еукаріот містять інтрони, які повинні вилучатися з транскріптной РНК перед перетворенням її в матричну, після чого слід сплайсинг (зрощення). Бактеріальні клітини не можуть здійснювати таку модифікацію РНК, що утворилася шляхом транскрипції гена еукаріотичної клітини. Тому якщо переслідують отримання білка шляхом експресії клонованого гена, то краще використовувати банк кДНК, отриманої на основі матричної РНК.
Інші розділи: