C12N9 / 48 - діючі на пептидні зв'язки, наприклад тромбопластин, лейцин амінопептідазу (3.4)
Власники патенту RU 2280076:
Тихоокеанський інститут біоорганічної хімії Далекосхідного відділення Російської Академії наук (RU)
Винахід відноситься до Поліферментні препаратів з морської тварини сировини і способам їх отримання і може знайти застосування в біотехнології, медицині, косметології, ветеринарії, сільському господарстві, в наукових дослідженнях і виробництві біохімічних реактивів. Препарат отримують шляхом гомогенізації гепатопанкреаса промислових видів крабів в буферних розчинах, видалення твердих домішок центрифугуванням гомогенату, флокуляції ліпідів хитозаном. Причому гомогенат додатково очищають центрифугуванням. Ультрафільтрацію розчину ферментного препарату ведуть на мембрані, що пропускає речовини з молекулярною масою 15 кДа і нижче, а потім на мембрані, що затримує речовини з молекулярною масою 50 кДа і вище. Розчин, що містить ферментативні активності, лиофилизируют. До складу Поліферментні препарату входять колагенолітичні і металлозавісімие протеїнази з молекулярної масою менше 30 кДа, рибонуклеази, дезоксирибонуклеази, фосфодіестерази, фосфатази, амілази, ліпази і # X003B2; -глюканази. Винахід забезпечує розширення арсеналу Поліферментні препаратів, збільшення виходу ферментного препарату за рахунок збільшення кількості типів ферментів, що входять в Поліферментні комплекс (протеази, нуклеази, глікозідази і ліпази), підвищення рівня активності гідролаз, розширення спектра можливого використання Поліферментні препарату в різних галузях промисловості. 2 з.п. ф-ли.
Винахід відноситься до Поліферментні препаратів з морської тварини сировини і способам їх отримання і може знайти застосування в біотехнології, медицині, косметології, ветеринарії, сільському господарстві, в наукових дослідженнях і виробництві біохімічних реактивів.
У ракоподібних (крабів, раків і креветок) гепатопанкреас є органом, що суміщає функції печінки і підшлункової залози. Через особливості харчування загону Decapoda гепатопанкреас секретує велику кількість травних ферментів, гидролизующих все класи природних полімерів і володіють широкою специфічністю і незвично високою активністю. Гепатопанкреас є доступним, дешевим і нетоксичним сировиною для отримання ферментних препаратів. В даний час з гепатопанкреаса крабів виділяють в високоочищеним або гомогенному стані колагенолітичні протеїнази, амінопептідазу, трипсин, еластазу і Ca, Mg-залежну ДНКаза.
У той же час отримані з гепатопанкреаса крабів Поліферментні препарати, містять, як правило, гідролази одного типу, а саме колагенолітичні протеїнази. На основі колагенолітичні протеїназ розроблені ранозагоювальні препарати "Коллалітін", "Морікраза", "Коллаза", "Коллагеназа КК".
Відомі такі способи отримання ферментних препаратів з гепатопанкреаса промислових видів крабів:
1. Спосіб отримання комплексу протеолітичних ферментів, що включає гомогенізацію сировини у водному розчині і осадження цільового продукту сульфатом амонію. Комплекс ферментів містить трипсин, карбоксипептидази А і Б, лейцінамінопептідази, лужні і нейтральні протеази [SU 546648 A1, 15.02.77].
2. Спосіб отримання комплексу протеолітичних ферментів з травних органів наземних і морських тварин, що включає екстракцію комплексу з подрібнених органів розчином хлористого кальцію, очистку від твердих домішок центрифугуванням і мікрофільтрацію через мембрани. Отриманий продукт (протеолітичний комплекс) містить лужні, нейтральні та кислі протеази, трипсин, хімотрипсин, коллагеназу [RU 2034028 C1, 30.04.95].
3. Спосіб отримання ферментного препарату, що включає екстракцію ферменту із замороженого гепатопанкреаса камчатського краба розчином хлориду лужного металу; відділення осаду пропусканням через фільтри з розміром пор 10 мм, 0,5 мм і 0,1 мм; мікрофільтрацію на мембранах з розміром пір 0,45 мкм; ультрафільтрацію на мембранах з межею пропускання 10 кДа. Ферментний препарат, названий "Коллалітіном", містить колагенолітичні протеази [RU 2096456 C1, 20.11.97].
Недоліком цього способу є тривалість процесу, що знижує вихід продукту і рівень його активності. Коллагеназа представлена трьома ізоферментами з молекулярної масою в межах від 18 до 27 кДа.
4. Найбільш близьким до заявляється способу за технічною суттю є спосіб отримання ферментного препарату з гепатопанкреаса промислових видів крабів, що володіє колагенолітичні активністю (колагенази). Спосіб передбачає гомогенизацию сировини шляхом автолиза в буферних розчинах, з подальшим додаванням до гомогенату розчину хітозану до його кінцевої концентрації 0,01-0,4%, відділенням нерозчинного матеріалу і послідовної ультрафільтрації ферментного розчину спочатку на мембрані, що відтинає баластні речовини з мол.м 100 кДа і більш, а потім на мембрані, що відтинає речовини з мол.м. 30 кДа і менш, збираючи фермент, що не проходить через мембрану. Розчин, що містить ферментативну активність, лиофилизируют [RU 2039819 C1, 20.07.95).
Спосіб-прототип досить простий у виконанні, не тривалий за часом, не вимагає токсичних реагентів. Однак в препараті, отриманому способом-прототипом, визначений тільки один тип гидролаз, а саме колагенолітичні протеїнази.
На основі цього комплексу в Тихоокеанському інституті біоорганічної хімії ДВО РАН створено ранозагоювальний засіб широкого спектра дії "Коллагеназа КК", в якому коллагеназа представлена, принаймні, трьома ізоферментами [RU 2093166 C1, 20.10.97].
В даний час область застосування відомого ферментного комплексу обмежена тільки його здатністю деградувати білки. У той же час у багатьох випадках успішне вирішення конкретної проблеми вимагає використання Поліферментні препаратів з більш широким спектром дії. Наприклад, для здійснення повної ензиматичною деструкції тварин і рослинних клітин при використанні продуктів гідролізу в біотехнологічної, мікробіологічної та харчової промисловості.
Завдання цього винаходу - створити Поліферментні препарат, здатний гідролізувати 4 класу природних біополімерів, такі як білки, нуклеїнові кислоти, полісахариди і ліпіди з метою його більш широкого і ефективного застосування; розширити арсенал комплексних ферментних препаратів, одержуваних з гепатопанкреаса промислових видів крабів і розробити спосіб його отримання.
В результаті вирішення поставленого завдання створений новий Поліферментні препарат, що містить колагенолітичні протеїнази, який відповідно до винаходу додатково містить металлозавісімие протеїнази, рибонуклеази, дезоксирибонуклеази, фосфодіестерази, фосфатази, амілази, ліпази і # X003B2; -глюканази. Його отримують шляхом гомогенізації гепатопанкреаса промислових видів крабів в буферних розчинах, видалення твердих домішок центрифугуванням гомогенату, флокуляції ліпідів хитозаном, ультрафільтрації розчину ферментного препарату на мембрані, що пропускає речовини з молекулярною масою 15 кДа і нижче, а потім на мембрані, що затримує речовини з молекулярною масою 50 кДа і вище.
Технічний результат забезпечується тим, що новий ферментний комплексний препарат містить 4 типи гидролаз - протеази, нуклеази, глікозідази і ліпази, тобто володіє більш широким спектром ферментативних активностей в порівнянні з відомим препаратом, що володіє тільки одним типом гідролазних активності, а саме - колагенолітичні.
У зв'язку з вищесказаним пропонований Поліферментні препарат може бути використаний на практиці з більшою ефективністю, ніж відомі. Наприклад, при використанні препарату в медицині при лікуванні гнійно-некротичних процесів, викликаних бактеріальною або вірусною інфекцією, ця ефективність буде забезпечуватися унікальним поєднанням літичної дії коллагеназ, протеїназ та нуклеаз і противірусного ефекту ДНКаз і РНКаз.
Крім того, пропонований комплекс може служити джерелом для отримання традиційними біохімічними методами індивідуальних ферментів або ферментних комплексів спрямованої дії, наприклад комплексу ДНКази і РНКази. Спільне присутність в пропонованому ферментному препараті ДНКази і РНКази дозволить створити для медицини, ветеринарії, сільського господарства противірусні препарати, які забезпечать можливість одночасно пригнічувати розмноження ДНК і РНК-вірусів у людини, тварин і рослин.
Новий препарат розширює арсенал комплексних ферментних препаратів.
Поставлена задача вирішена також способом отримання ферментного препарату, що містить колагенолітичні протеїнази, що включає гомогенізацію гепатопанкреаса промислових видів крабів, додавання до гомогенату розчину хітозану, відділення нерозчинного матеріалу з подальшою ультрафильтрацией отриманого розчину і лиофилизацией цільового продукту, в якому відповідно до винаходу гомогенат піддають додатковому очищенню шляхом центрифугування, а ультрафільтрацію здійснюють на мембрані, що пропускає речовини з молекулами ної масою 15 кДа і нижче, збираючи ферментний препарат, що не проходить через мембрану. Потім отриманий концентрат ферментного препарату, що містить 4 типи гидролаз, пропускають через мембрану, що затримує речовини з молекулярною масою 50 кДа і вище. В результаті отримують препарат, додатково містить колагенолітичні і металлозавісімие протеїнази з молекулярної масою менше 30 кДа, рибонуклеази, дезоксирибонуклеази, фосфодіестерази, фосфатази, амілази, ліпази і # X003B2; -глюканази.
Спосіб може бути здійснений як при низькій температурі, наприклад 5 # x000B0; С (в умовах холодної кімнати), так і при кімнатній температурі.
Хтозна додають до гомогенату у вигляді розчину сольовий форми з органічної або мінеральної кислотами. Введення стадії додаткового очищення шляхом центрифугування гомогенату дозволяє знизити концентрацію хітозану до 0,001%, що, в свою чергу, зменшує втрати білка, пов'язані з сорбцией білка на хітозаном, а в результаті - підвищує вихід ферментного комплексу.
Використання мембран з проникною здатністю нижче 50 кДа дає можливість прибрати баластні біополімери з молекулярною масою вище 50 кДа, і, таким чином, підвищити питому активність ферментів, присутніх в комплексі.
Сукупність суттєвих ознак заявляється способу забезпечує отримання технічного результату, який полягає в збільшенні виходу ферментного препарату за рахунок збільшення кількості типів ферментів, що входять в Поліферментні комплекс (протеази, нуклеази, глікозідази і ліпази), і в підвищенні рівня активності гідролаз.
Приклади здійснення винаходу.
Отримують 80 г комплексного ферментного препарату. Препарат містить 0,8 мг білка на мг препарату. Ліпіди в препараті відсутні.
Приклад 2. гепатопанкреас промислових видів крабів (10 кг) подрібнюють і поміщають в 30 л води, доводячи рН розчину бикарбонатом до значення 8,3 і витримують при перемішуванні протягом 6 ч, при температурі 5 С # x000B0 ;. Потім розчин центрифугують при 3000 g і додають до супернатанту при інтенсивному перемішуванні розчин хітозану в 0,5 н. соляній кислоті, доводячи кінцеву концентрацію хітозану до 0,001%, рН розчину при флокуляції - 7,0. Далі процес проводять так, як описано в прикладі 1, при рН буферного розчину 8,3.
Отримують 78,0 г комплексного ферментного препарату. Препарат містить 0,85 мг білка на мг препарату. Ліпіди в препараті відсутні.
Отримують 7,2 г комплексного ферментного препарату. Препарат містить 0,75 мг білка на мг препарату. Ліпіди в препараті відсутні.
Отримують 7,4 г комплексного ферментного препарату. Препарат містить 0,78 мг білка на мг препарату. Ліпіди в препараті відсутні.
Ферментний препарат, одержуваний заявляється способом, має наступні характеристики:
порошок жовтувато-сірого кольору, розчинний в дистильованої воді або буферному розчині, з легким специфічним запахом; препарат не містить іонів важких металів, домішок, шкідливих і токсичних речовин; препарат практично не втрачає активності протягом 4-х років зберігання в лиофильно висушеному стані при температурі + 10 # x000B0; С;
питома колагенолітичні активність (колаген I типу) складає не менше 1,5 Од / мг препарату / хв (визначення питомої колагенолітичні активності проводять за методикою МА 123.12.002-92);
питома активність тріпсіноподобних протеїнази (N-бензоїл-аргініну-р-нітроаніліда) становить не менше 3,3 Од / мг препарату / хв (визначення протеїназного активності проводять за методом Ерлангера);
питома загальна протеолітична активність (казеїн) становить не менше 0,7 Од / мг препарату / хв (визначення протеолітичної активності проводять за стандартною методикою відповідно до ГОСТ 20264.2-88);
питома активність лужної РНКази становить не менше 35 Од / мг препарату / год;
питома активність кислої РНКази становить не менше 10 Од / мг препарату / год;
питома ДНКазной активність становить не менше 400 Од / мг препарату / год;
питома активність лужної фосфатази становить не менше 0,04 Од / мг препарату / хв;
питомі активності лужної і кислої фосфодіестераз становлять не менше 0,003 Од / мг препарату / хв;
питома активність # X003B2; -глюканази становить не менше 0,01 Од / мг препарату / хв;
питома амілазна активність становить не менше 0,01 Од / мг препарату / хв;
питома ліпазная активність становить не менше 250 Од / мг препарату / хв.
Визначення активностей ферментів проводять за методиками, наведеними в каталогах фірми Sigma.
У процесі досліджень було встановлено, що молекулярна маса ферментів комплексу, що володіють найбільшою активністю, становить 15-42 кДа. Найбільш активними компонентами комплексу є серинові колагенолітичні протеїнази, металлопротеінази, лужна ДНКаза, лужна і кисла РНКази, амілаза.
1. Спосіб отримання ферментного препарату з гепатопанкреаса промислових видів крабів, що містить колагенолітичні протеїнази, що передбачає гомогенизацию гепатопанкреаса промислових крабів в буферному розчині, додавання розчину хітозану в кислоті, відділення нерозчинного матеріалу з подальшою ультрафильтрацией отриманого розчину і лиофилизацией цільового продукту, що відрізняється тим, що гомогенат піддають додаткової очистки шляхом центрифугування, а ультрафільтрацію здійснюють на мембрані, що пропускає еществ з молекулярної масою 15 кДа і нижче, збираючи ферментний препарат, що не проходить через мембрану, потім сконцентрований і знесоленої екстракт пропускають через мембрану, що затримує речовини з молекулярною масою 50 кДа і вище, з отриманням препарату, додатково містить металлозавісімие протеїнази, рибонуклеази, дезоксирибонуклеази, фосфодіестерази, фосфатази, амілази, ліпазу і # X003B2; -глюканазу.
2. Спосіб за п.1, що відрізняється тим, що гомогенизацию і очищення здійснюють при рН ферментного розчину 5,5-9,5 і температурі 5-20 # x000B0; С.
3. Ферментний препарат з гепатопанкреаса промислових видів крабів, що містить колагенолітичні протеїнази, що відрізняється тим, що він додатково містить металлозавісімие протеїнази, рибонуклеази, дезоксирибонуклеази, фосфатази, фосфодіестерази, амілази, ліпазу і # X003B2; -глюканазу і отриманий способом по п.1 або 2.