Винахід відноситься до біотехнології, зокрема до отримання інгібіторів колагенази, і може бути використано в ветеринарії, харчовій промисловості, а також для дослідницьких цілей. Спосіб передбачає гомогенизацию гепатопанкреаса промислових видів краба в 0,1 М ацетат амонію, що містить 0,1-1 мМ ацетату кальцію при рН 6,4-7,0. Гомогенат центрифугують. До отриманого супернатанту додають сульфат амонію до 60-70% -ного насичення і центрифугують. Отриманий комплекс ферментів розчиняють в дистильованої воді з додаванням 0,1-1 мМ ацетату кальцію до отримання істинного розчину з подальшою його очищенням і концентруванням. Обессолівают ферменти на поліволоконной мембрані з розміром пір 100 кДа. Супернатант, що містить інгібітор колагенази, промивають дистильованою водою. Прогрівають до 60-100 ° С і відокремлюють осад центрифугуванням. Розчин ферментів лиофильно висушують. 2 з.п. ф-ли, 1 мул. 1 табл.
Винахід відноситься до біотехнології, зокрема до отримання високоочищених і високоактивних препаратів інгібіторів ферментів, які можуть бути використані в медицині, косметології, ветеринарії та харчової промисловості, а також для дослідницьких цілей.
Колагенази камчатського краба успішно використовуються в медицині для лікування опіків, гнійно-трофічних виразок, післяопераційних рубців. Механізм процесу загоєння ран при застосуванні препарату протеолітичного / колагенолітичні дії полягає в лизисе некротичних тканин, що призводить до очищення рани. Наступною стадією є процес загоєння рани, відновлення нових клітин тканин і шкіри. Якщо концентрація коллагеназ і колагенолітичні ферментів в препараті дуже велика, то процеси відновлення можуть сповільнитися за рахунок гідролізу цими ферментами колагену здорових тканин, тому необхідно блокувати ферментативна дія. Особливо це важливо при лікуванні очних захворювань. Найбільш фізіологічний спосіб - застосування відповідних інгібіторів, однак як колагенази, так і колагенолітичні ферменти стійкі до дії відомих інгібіторів трипсину і хімотрипсину. Колагенази викликають деградацію колагену, що пов'язано з передчасним старінням шкіри. Тому інгібітор коллагеназ можна ввести в різні косметичні засоби (креми, лосьйони, гелі, мазі) для запобігання утворенню зморшок або лікування атрофії шкіри.
Відомий спосіб отримання інгібітору протеїназ (але не коллагеназ) з органів великої рогатої худоби, який полягає в тому, що сировина подрібнюють, проводять екстракцію в кислому середовищі, обробляють екстракт, після видалення осаду цільової продукт виділяють хроматографією на адсорбенті силікатної типу і в облогу з елюата органічними розчинниками. За вказаним способом вдається виділити продукт з активністю 500-1500 КИЕ / мг, проте вказаний продукт не відповідає вимогам, що пред'являються до медичних препаратів інгібітора протеїназ.
Патент Німеччини №1492114, А 61 К 17/00, 1972.
Відомий спосіб отримання інгібітору колагенази з акулячих хрящів. Екстракти хрящів акули мають антиангіогенної, безпосередній протівоопухолевопроліферірующей, антизапальні і антіколлагенолітіческой активностями. Спосіб включає стадії отримання гомогенату хряща в водному розчині, центрифугування цього гомогената і подальшого його фракціонування до отримання повного екстракту, що містить молекули до 500 кДа. Додаткове фракціонування екстракту за допомогою ультрафільтрації на мембранних фільтрах і гель-фільтрації на Суперозе S-12 і гідрофобною хроматографії на колонці з СДС-S-гексил в режимі FPLC (рідинної хроматографії високого тиску) дозволило виділити одну з фракцій екстракту (до 10 кДа), володіє антіколлагенолітіческой активністю. Інгібіторна дію на коллагеназу 1 типу (ММТ1) визначали по флюорогенному субстрату і за допомогою електрофорезу в SDS-PAGE.
Спосіб дуже складний у виконанні, тому що на стадії фракціонування включає безліч трудомістких складних операцій, здійсненних тільки в добре обладнаних лабораторіях. Крім того, джерело інгібітора - акулячий хрящ практично не містить протеолітичні ферменти, і інгібітор, отриманий за вищевказаною способу, відноситься до інгібіторів металопротеїназ.
Найближчим технічним рішенням є спосіб отримання основного інгібітору протеїназ (але не коллагеназ), з органів великої рогатої худоби, що полягає в тому, що органи великої рогатої худоби, що містять інгібітор (легкі, підшлункова залоза, слинні залози, подрібнюють (гомогенизируют), проводять екстракцію в кислому середовищі, відокремлюють макуха, видаляють ліпіди і білки, центрифугують, основний екстракт-інгібітор протеїназ хроматографіруют на сульфокатіоніте, елюат обробляють соляною кислотою до рН 1-3, видаляють осад баластних белко , Отриманий супернатант обробляють трихлороцтової кислотою до її концентрації 2,5-7,0%, повторно видаляють домішкові білки, з надосадової рідини висолюють основний інгібітор протеїназ, який потім очищають хроматографією на сефадексе, а потім виділяють препарат осадженням ацетоном або ліофільної сушінням. Отримують апірогенний препарат, активність якого не менше 5000 КІО / мг.
Недоліками способу є многостадийность процесу, використання великої кількості легкозаймистих дорогих органічних розчинників (спирт, ацетон) і високих концентрацій трихлороцтової кислоти (50%), соляної кислоти і їдкого натру, які вимагають при використанні особливих умов, також негативно впливають на екологічні умови, вимагаючи розробки спеціальних способів утилізації відходів виробництва. Істотним недоліком є застосування на стадії знесолення препарату колонки з дорогим сефадексом імпортного виробництва. По суті цей багатоступінчастий лабораторний метод отримання інгібітору не піддається масштабування.
Завданням винаходу є створення способу виділення невідомого раніше ендогенного інгібітора колагенолітичні ферментів з гепатопанкреаса камчатського краба економічним способом.
Поставлена задача вирішується тим, що в способі отримання інгібітору колагенази, що включає гомогенізацію сировини, що містить протеолітичні ферменти, спосіб характеризується проведенням гомогенізації сировини в 0,1 М ацетат амонію, що містить 0,1-1 мМ ацетату кальцію при рН 6,4-7, 0, гомогенат потім центрифугують, до супернатанту додають сульфат амонію до 60-70% насичення, отриманий комплекс ферментів відокремлюють центрифугуванням, розчиняють останній в дистильованої воді з додаванням 0,1-1 мМ ацетату кальцію до отримання істинного раст ора з наступним очищенням, концентрування і обессоливанием ферментів на поліволоконной мембрані з розміром пір 100 кДа і промиванням супернатанта, що містить інгібітор колагенази дистильованою водою, з наступним прогріванням до 60-100 ° С, відділенням осаду центрифугуванням і ліофільним висушуванням.
Зазвичай супернатант промивають дистильованою водою не менше 3-х разів, а прогрівання супернатанта ведуть переважно при 80-85 ° С протягом 25-40 хв.
Гепатопанкреас крабів, особливо камчатського краба, є джерелом протеолітичних ферментів, в тому числі і коллагеназ, здатних утворювати комплекси з ендогенних інгібітором, колагенолітичні ферменти гепатопанкреаса краба відносяться до особливого сімейства ферментів - брахіурінам. Це серинові протеїнази, що поєднують в собі властивості трипсину і хімотрипсину, тому інгібітори металопротеїназ на них не діють. Гепатопанкреас є доступним, дешевим і нетоксичним сировиною для отримання ферментних препаратів, тому виділення невідомого раніше ендогенного інгібітора колагенолітичні ферментів з гепатопанкреаса камчатського краба є основним завданням цього винаходу.
Отриманий відповідно до запропонованим способом інгібітор є порошок світло-коричневого відтінку, добре розчинний у водних буферних розчинах.
При дослідженні інгібуючої дії отриманого препарату із застосуванням хромогенного субстрату колагенолітичні серинових протеїнази PC Glp-Ala-Ala-Leu-pNA було показано, що інгібуюча активність є дозозависимой. Результати досліджень наведені в таблиці.
Інгібування коллагеназной активності препарату «Морікраза» було підтверджено електрофорезом гідролізату колагену типу I.
На кресленні показана електрофоретична характеристика інгібітора і його інгібуючої дії колагенолітичні активності препарату «Морікраза». 12% ПААГ, інкубація проводилася при кімнатній температурі. Доріжка 1 - препарат «Морікраза», доріжка 2 - препарат інгібітору, доріжка 3 - вихідний препарат колагену типу I, доріжка 4 - препарат колагену + препарат «Морікраза» в співвідношенні 30: 1, час інкубації 1 годину, + препарат інгібітору без інкубації з ним; доріжки 5-8: час інкубації з інгібітором 2 години, співвідношення фермент: інгібітор = 1: 100 - доріжки 5 (час інкубації колагену з «Морікразой» 1 годину) і доріжка 6 (час інкубації колагену з «Морікразой» 24 години); співвідношення фермент: інгібітор = 1:50 - доріжка 7 (час інкубації колагену з «Морікразой» 1. годину) і доріжка 8 (інкубації колагену з «Морікразой» час 24 години). Стрілкою відзначено положення смуги, відповідної незруйнованим колагену.
Коллагеназной дію препарату блокується при наявності ендогенного інгібітора в співвідношенні фермент: інгібітор не менше ніж 1: 100.
Як видно з креслення, тільки при співвідношенні препарат «Морікраза»: інгібітор = 100: 1 спостерігається повне інгібування істинної коллагеназной активності (див. Доріжки 5 і 6). Чистоту інгібітора демонструє доріжка 2, де видно тільки дві інтенсивні білкові смуги. Можливо це ізоформи одного і того ж інгібітору.
Пропонований спосіб дозволяє отримати невідомий раніше ендогенний інгібітор колагенолітичні ферментів з гепатопанкреаса камчатського краба досить економічним способом завдяки використанню методу мікрофільтрації на спеціально підібраних мембранах. Це дозволяє значно скоротити час проведення процесу і здешевити виробництво інгібітору. Проведення мікрофільтрації на мембрані з розміром пір 100 кДа дозволяє видаляти низькомолекулярні домішки і колагенолітичні ферменти, повністю зберігаючи інгібітор, здійснити знесолення і концентрування препарату на тому ж апараті, що призводить до отримання концентрованих розчинів, час висушування яких значно скорочується. Висолювання білків дешевим сульфатом амонію при слабокислом і нейтральному рН сприяє збереженню активності інгібіторів і здешевлення процесу. Крім того, застосування ацетату і сульфату амонію для екстракції і висолювання інгібітора замість спирту, ацетону, трихлороцтової кислоти, що застосовуються по прототипу, більш вдало з точки зору екологічної безпеки процесу, тому що розчини солей амонію при розведенні можуть бути використані для добрива рослин.
формула винаходу
1. Спосіб отримання інгібітору колагенази з гепатопанкреаса промислових видів краба, що характеризується проведенням гомогенізації сировини в 0,1 М ацетат амонію, що містить 0,1-1 мМ ацетату кальцію при рН 6,4-7,0, гомогенат центрифугують, до супернатанту додають сульфат амонію до 60-70% -ного насичення, отриманий комплекс ферментів відокремлюють центрифугуванням, розчиняють останній в дистильованої воді з додаванням 0,1-1 мМ ацетату кальцію до отримання істинного розчину з наступним очищенням, концентрування і обессоливанием ферментів на поліволоконной мембрані з розміром пір 100 кДа і промиванням супернатанта, що містить інгібітор колагенази, дистильованою водою з наступним прогріванням до 60-100 ° С, відділенням осаду центрифугуванням і ліофільним висушуванням.
2. Спосіб за п.1, що відрізняється тим, що супернатант промивають дистильованою водою не менше 3 разів.
3. Спосіб за п.1, що відрізняється тим, що прогрівання супернатанта ведуть переважно при 80-85 ° С протягом 25-40 хв.