Матричний синтез ДНК
Здатність клітин підтримувати високу упорядкованість своєї організації залежить від генетичної інформації, яка зберігається в формі дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). ДНК - це речовина, з якої складаються гени. Розмноження живих організмів, передача спадкових властивостей з покоління в покоління і розвиток багатоклітинного організму із заплідненої яйцеклітини можливі тому, що ДНК здатна до самовідтворення. Сам процес самовідтворення ДНК називається реплікацією. Іноді використовують також назва-синонім - редуплікація.
Оскільки два ланцюги мають протилежну спрямованість, їх називають антипаралельними. Легко уявити, що подвоєння ДНК відбувається внаслідок того, що ланцюги розходяться, а потім кожна ланцюг служить матрицею, на якій збирається комплементарна їй новий ланцюг ДНК. В результаті утворюються дві дочірні, двоспіральні, відрізнити за будовою від батьківської ДНК молекули. Кожна з них складається з одного ланцюга початкової батьківської молекули ДНК і одній знову синтезованої ланцюга. Такий механізм реплікації ДНК, при якому від одного покоління до іншого передається одна з двох ланцюгів, складових батьківську молекулу ДНК, отримав назву напівконсервативним і був експериментально доведений в 1958 році М. Мезельсоном і Ф. Сталь.
Крім того, ситезу ДНК характерні такі властивості, як антипаралельність і уніполярність. Кожна ланцюг ДНК має певну орієнтацію. Один кінець несе гідроксильну групу (ОН), приєднаної до 3'-вуглецю в цукрі дезоксирибози, на іншому кінці ланцюга знаходиться залишок фосфорної кислоти в 5'-положенні цукру. Дві комплементарні ланцюги в молекулі ДНК орієнтовані в протилежних напрямках - антипараллельно (при паралельній орієнтації напроти 3'-кінця одного ланцюга знаходився б 3'-кінець інший). Ферменти, що синтезують нові нитки ДНК, звані ДНК-полімерази, можуть пересуватися уздовж матричних ланцюгів лише в одному напрямку - від їх 3'-решт до 5'-кінців. При цьому синтез комплементарних ниток завжди ведеться в 5 '3' напрямку, тобто уніполярні. Тому в процесі реплікації одночасний синтез нових ланцюгів йде антипараллельно.
ДНК-полімерази можуть давати "задній хід", тобто рухатися в напрямку 3 '5'. У тому випадку, коли останнє доданий при синтезі нуклеотидное ланка виявилася некомплементарни нуклеотиду матричної ланцюга, воно буде заміщено комплементарним нуклеотидів. Отщепа "неправильний" нуклеотид, ДНК-полімераза продовжує синтез в 5 '3' напрямку. Така здатність до виправлення помилок отримала назву коректорській функції ферменту.
У 1957 році А. Корнберг виявив у кишкової палички фермент, що каталізує процес полімеризації ДНК з нуклеотидів; він був названий ДНК-полімеразою. Потім ДНК-полімерази виявили і в інших організмах. Було показано, що субстратами всіх цих ферментів служать дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), полімеризуються на одноцепочной ДНК-матриці. ДНК-полімерази послідовно нарощують одноцепочной ланцюг ДНК, крок за кроком приєднуючи до неї наступні ланки в напрямку від 5 'до 3' кінця, причому вибір чергового дНТФ диктується матрицею. Приєднання кожного нового нуклеотидного залишку до 3'-кінця зростання ланцюга супроводжується гідролізом багатою енергією зв'язку між першим і другим фосфатними залишками в дНТФ і отщеплением пірофосфату, що робить реакцію в цілому енергетично вигідною.
У клітинах зазвичай присутні кілька типів ДНК-полімерази, що виконують різні функції і мають різну будову. Вони можуть бути побудовані з різної кількості білкових ланцюгів (субодиниць), від однієї до десятків, проте всі вони працюють на будь-яких послідовностях нуклеотидів матриці. Завдання цих ферментів - зробити точну копію кожної матриці.
7.2 Ініціація ланцюгів ДНК
ДНК-полімерази не можуть починати синтезу ДНК на матриці, а здатні лише додавати нові дезоксірібонуклеотідние ланки до 3'-кінця вже наявної полінуклеотидних ланцюга. Таку заздалегідь утворену ланцюг, до якої додаються нуклеотиди, називають запалом. Коротку РНК приманку синтезує з рибонуклеозидтрифосфатов фермент, що не володіє коректує активністю і званий ДНК-праймазой (від англ. Primer - запал). Праймазная активність може належати або окремому ферменту, або одній з субодиниць ДНК-полімерази. Запал, синтезована цим неточним ферментом, що не уміє виправляти помилки, відрізняється від решти новосинтезованих ланцюга ДНК, оскільки складається з рибонуклеотидов, і далі може бути видалена.
Розмір рібонуклеотідной затравки невеликий (менше 20 нуклеотидів) в порівнянні з розміром ланцюга ДНК, утвореною ДНК-полімеразою. Виконала свою функцію РНК-запал віддаляється спеціальним ферментом, а утворена при цьому пролом закладається ДНК-полімеразою, що використовує в якості затравки 3'-ОН-кінець сусіднього фрагмента. Видалення крайніх РНК-праймерів, комплементарних 3'-кінців обох ланцюгів лінійної материнської молекули ДНК, призводить до того, що дочірні ланцюга виявляються коротше на 10-20 нуклеотидів (у різних видів розмір РНК-затравок різний). У цьому полягає так звана "проблема недореплікаціі решт лінійних молекул". У разі реплікації кільцевих бактеріальних ДНК цієї проблеми не існує, так як перші за часом освіти РНК-затравки видаляються ферментом, який одночасно заповнює утворюється пролом шляхом нарощування 3'-ОН-кінця зростання ланцюга ДНК, спрямованої в "хвіст" видаляється праймеру. Проблема недореплікаціі 3'-решт лінійних молекул ДНК вирішується еукариотическими клітинами за допомогою спеціального ферменту - теломерази. У 1985 році він був виявлений у равнореснічной інфузорії Tetrahymena thermophila, а згодом - в дріжджах, рослинах і тваринах, в тому числі в яєчниках людини.
Теломераза є ДНК-полімеразою, добудовують 3'-кінці лінійних молекул ДНК хромосом короткими (6-8 нуклеотидів) повторюваними послідовностями (у хребетних TTAGGG). Згідно номенклатурі, цей фермент називають ДНК-нуклеотіділекзотрансферазой або теломерной термінальної трансферази. Крім білкової частини теломераза містить РНК, що виконує роль матриці для нарощування ДНК повторами. Довжина теломеразной РНК коливається від 150 нуклеотидів у найпростіших до 1400 нуклеотидів у дріжджів, у людини - 450 нуклеотидів. Сам факт наявності в молекулі РНК послідовності, по якій йде матричний синтез шматка ДНК, дозволяє віднести теломеразу до своєрідну обернену транскриптазе, тобто ферменту, здатному вести синтез ДНК по матриці РНК.
В результаті того що після кожної реплікації дочірні ланцюга ДНК виявляються коротше материнських на розмір першого РНК-праймера (10-20 нуклеотидів), утворюються виступаючі однониткових 3'-кінці материнських ланцюгів. Вони-то і впізнаються теломеразой, яка послідовно нарощує материнські ланцюга (у людини на сотні повторів), використовуючи 3'-ОН-кінці їх в якості запалів, а РНК, що входить до складу ферменту, як матрицю. Утворені довгі одноцепочной кінці, в свою чергу, служать матрицями для синтезу дочірніх ланцюгів по традиційному реплікативного механізму.
Поступове скорочення ДНК хромосом під час реплікації є однією з теорій "старіння" клітинних колоній. Ще в 1971 році вітчизняний вчений А.М. Оловников в своїй теорії маргінотоміі (від лат. Marginalis -краевой, tome - перетин) припустив, що це явище лежить в основі обмеженого потенціалу подвоєння, спостережуваного у нормальних соматичних клітин. Американський вчений Леонард Хейфлик на початку 60-х років показав, що якщо для культивування взяти клітини новонароджених дітей, то вони можуть пройти 80-90 поділів, в той час як соматичні клітини від 70-річних діляться тільки 20- 30 раз. Обмеження на число клітинних поділів і називають лімітом Хейфліка.
7.3 Розплітання подвійної спіралі ДНК
Оскільки синтез ДНК відбувається на одноцепочечной матриці, йому повинно передувати обов'язкове поділ (хоча б на час) двох ланцюгів ДНК. Дослідження, проведені на початку 60-х років на реплицирующихся хромосомах, виявили особливу, чітко обмежену область реплікації, що переміщається уздовж батьківської спіралі ДНК і що характеризується місцевим розбіжністю двох її ланцюгів. Ця активна область з-за своєї Y-подібної форми була названа репликационной виделкою. Саме в ній ДНК-полімерази синтезують дочірні молекули ДНК.
За допомогою електронної мікроскопії реплицирующейся ДНК вдалося встановити, що область, яка вже реплицирована, має вигляд вічка усередині нерепліціровавшейся ДНК. Важливо відзначити, що реплікаційний вічко утворюється лише в тих місцях молекули, де знаходяться специфічні нуклеотидні послідовності. Ці послідовності, що отримали назву точок початку реплікації. складаються приблизно з 300 нуклеотидів. Залежно від того, в одному або в двох напрямках відбувається реплікація (а це залежить від природи організму), око містить одну або дві Реплікаційний вилки. Послідовний рух вилки реплікації призводить до розширення вічка.
Подвійна спіраль ДНК вельми стабільна; для того щоб вона розкрилася, необхідні особливі білки. Спеціальні ферменти ДНК-ХЕЛІКАЗИ швидко рухаються по одиночній ланцюга ДНК, використовуючи для переміщення енергію гідролізу АТФ. Зустрічаючи на шляху ділянку подвійної спіралі, вони розривають водневі зв'язки між підставами, поділяють ланцюга і просувають вилку реплікації. Слідом за цим з одиночними ланцюгами ДНК зв'язуються спеціальні дестабілізуючі спіраль білки, які не дозволяють одиночним ланцюгах ДНК зімкнуться. При цьому вони не закривають підстав ДНК, залишаючи їх доступними для спарювання.
Не слід забувати, що комплементарні ланцюга ДНК закручені один навколо одного в спіраль. Отже, для того щоб репликационная вилка могла просуватися вперед, вся ще не подвоєна частина ДНК повинна була б дуже швидко обертатися. Ця топологічна проблема вирішується шляхом освіти в спіралі свого роду "шарнірів", дозволяють ланцюгах ДНК розкрутитися. Належать до особливого класу білки, звані ДНК-топоізомеразами, вносять в ланцюг ДНК одно- або дво- ланцюгові розриви, що дозволяють ланцюгах ДНК розділитися, а потім закладають ці розриви. Топоізомерази беруть участь також в расцеплении зачеплених дволанцюжкових кілець, що утворюються при реплікації кільцевих двунітевих ДНК. За допомогою цих важливих ферментів подвійна спіраль ДНК в клітині може приймати "недокрученную" форму з меншим числом витків; в такий ДНК легше відбувається розбіжність двох ланцюгів ДНК в вилці реплікації.
7.4Преривістий синтез ДНК
Легко уявити, що реплікація відбувається шляхом безперервного зростання нуклеотида за нуклеотидом обох нових ланцюгів у міру переміщення вилки реплікації; при цьому, оскільки два ланцюги в спіралі ДНК антіпараллельни, одна з дочірніх ланцюгів повинна була б зростати в напрямі 5-3 ', а інша в напрямі 3-5'. Насправді, однак, виявилося, що дочірні ланцюга ростуть тільки в напрямку 5'-3 ', тобто завжди подовжується 3'-кінець затравки, а матриця зчитується ДНК-полімеразою в напрямі 3-5'.Ето твердження на перший погляд здається несумісним з рухом вилки реплікації в одному напрямку, що супроводжується одночасним зчитуванням двох антипаралельних ниток.
Розгадка секрету полягає в тому, що синтез ДНК відбувається безперервно тільки на одній з матричної ланцюгів. На другий матричної ланцюга ДНК синтезується порівняно короткими фрагментами (довжиною від 100до 1000 нуклеотидів, залежно від виду), названими по імені виявив їх вченого фрагментами Окадзакі. Новостворена ланцюг, яка синтезується безперервно, називається провідною, а інша, що збирається з фрагментів Окадзакі, що відстає. Синтез кожного з цих фрагментів починається з РНК-затравки. Через деякий час РНК-затравки видаляються, проломи забудовуються ДНК-полімеразою і фрагменти зшиваються в один безперервний ланцюг ДНК спеціальним ферментом.
7.5 Кооперативний дію білків вилки реплікації
До сих пір ми говорили про участь окремих білків в реплікації так, як ніби-то вони працюють незалежно один від одного. Тим часом насправді велика частина цих білків об'єднана в крупний комплекс, який швидко рухається уздовж ДНК і погоджено здійснює процес реплікації з високою точністю. Цей комплекс порівнюють з малесенькою "швейної машиною": "деталями" його служать окремі білки, а джерелом енергії - реакція гідролізу нуклеозидтрифосфатів. Спіраль розплітається ДНК-ХЕЛІКАЗОЙ; цього процесу допомагають ДНК - топоізомераза, що розкручує ланцюга ДНК, і безліч молекул дестабілізуючого білка, що зв'язуються з обома одиночними ланцюгами ДНК.
В області вилки діють дві ДНК-полімерази - на провідній і відстає ланцюга. На провідною ланцюга ДНК-полімераза працює безперервно, а на відстає фермент час від часу перериває і знову відновлює свою роботу, використовуючи короткі РНК-затравки, синтезовані ДНК-праймазой. Молекула ДНК-ПРАЙМАЗИ безпосередньо пов'язана з ДНК-ХЕЛІКАЗОЙ, утворюючи структуру, звану праймосомой. Праймосома рухається в напрямку розкриття вилки реплікації і по ходу руху синтезує РНК-затравки для фрагментів Окадзакі. У цьому ж напрямку рухається ДНК-полімераза провідною ланцюга і, хоча на перший погляд це важко уявити, ДНК-полімераза відстає ланцюга. Для цього, як вважають, остання накладає ланцюг ДНК, яка служить їй матрицею, саму на себе, що і забезпечує розворот ДНК-полімерази відстає ланцюга на 180 градусів. Узгоджений рух двох ДНК-полімераз забезпечує координовану реплікацію обох ниток. Таким чином, в вилці реплікації одночасно працюють близько двадцяти різних білків (з яких ми назвали тільки частина), здійснюючи складний, високоупорядоченние і енергоємний процес.
Майже півстоліття тому було відкрито принцип структурної (молекулярної) організації генного речовини - дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). Структура ДНК дала ключ до механізму точного відтворення генного речовини. Так виникла нова наука - молекулярна біологія. Була сформульована так звана центральна догма молекулярної біології: ДНК - РНК - білок. Сенс її полягає в тому, що генетична інформація, записана в ДНК, реалізується у вигляді білків, але не безпосередньо, а через посередництво родинного полімеру - рибонуклеїнової кислоту (РНК), і цей шлях від нуклеїнових кислот до білків незворотній. Таким чином, ДНК синтезується на ДНК, забезпечуючи власне відтворення вихідного генетичного матеріалу в поколіннях. Отже, саме ДНК визначає спадковість організмів, тобто відтворюється в поколіннях набір білків і пов'язаних з ними ознак. Біосинтез білка є центральним процесом живої матерії, а нуклеїнові кислоти забезпечують його, з одного боку, програмою, яка визначає весь набір і специфіку синтезованих білків, а з іншого - механізмом точного відтворення цієї програми в поколіннях. Отже, походження життя в її сучасній клітинної формі зводиться до виникнення механізму успадкованого біосинтезу білків.
Інтернет: www.bankreferatov.ru; www.referatov.net; www.5ballov.ru
З.А. Шабарова і А.А. Богданов - Хімія нуклеїнових кислот і їх полімерів.
А. Мікельсон - Хімія нуклеозидов і нуклеотидів.
Гауптман, Ю. Грефе, Х. Ремане - Органічна хімія.
Б.А.Павлов, А.П.Терентьев «Курс органічної хімії».
О. О. Фаворова. Збереження ДНК в ряду популяцій: реплікація ДНК.