реакції аглютинації
У цих реакціях беруть участь антигени у вигляді частинок (мікробні клітини, еритроцити та інші корпускулярні антигени), які склеюються антитілами і випадають в осад.
Для постановки реакції аглютинації (РА) необхідні три компоненти: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитіло (агглютинин) і 3) електроліт (ізотонічний розчин натрію хлориду).
Аг + АТ + електроліт = агглютінати
1. Постановка орієнтовною реакції аглютинації (РА) на склі з метою ідентифікації бактерій кишкової групи.
На предметне скло наносять краплями:
1 -а крапля: - агглютинируют сироватка до збудників дизентерії;
2 -а крапля: - агглютинируют сироватка до збудників черевного тифу;
3 -ья крапля: - фізіологічний розчин (контроль).
Додають в кожну краплю досліджувану чисту культуру бактерій. Перемішують.
Примітка. позитивний результат - наявність пластівців агглютіната,
негативний - відсутність пластівців агглютіната
Висновок: Досліджувані бактерії є збудниками черевного тифу.
2. Облік результатів РНГА. поставленої з метою виявлення ботулотоксину.
Збудник ботулізму - Clostridium botulinum виробляє токсини семи сероварів (А, B, C, D, E, F, G), однак частіше за інших зустрічаються серовар А, В, Е. Всі токсини відрізняються за антигенними властивостями і можуть бути диференційовані в реакціях типоспецифічними сироватками . Для цієї мети можна поставити реакцію пасивної (непрямий) гемаглютинації з сироваткою хворого, в якій передбачається наявність токсину, і еритроцитами, навантаженими антитілами антитоксических Протиботулінічні сироваток типів А, В, Е. Контролем служить нормальна сироватка.
Мал. 3. Постановка і результат РНГА.
Облік. У позитивному випадку еритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), в негативному - осідають у вигляді гудзики або колечка.
Висновок: У сироватці хворого виявлено ботулотоксин тип Е.
Реакція преципітації - це формування осадження комплексу розчинної молекулярного антигену з антитілами у вигляді помутніння, званого преципітатом. Він утворюється при змішуванні антигенів і антитіл в еквівалентних кількостях. Реакцію преципітації ставлять в пробірках (реакція кольцепреціпітаціі), в гелях, поживних середовищах та ін.
3. Постановка і облік реакції кольцепреціпітаціі для визначення видової приналежності кров'яного плями.
Постановка. У вузьку пробірку №1 діаметром 0,5 см з нерозведеної Преципітуючих сироваткою проти білків крові людини в кількості 0,3-0,5 мл, тримаючи її в похилому положенні, пастерівської піпеткою повільно по стінці нашаровується такий же обсяг антигену (екстракт кров'яного плями) . В пробірку №2 доливають преціпітаціонную сироватку проти білків барана, в пробірку №3 - фізіологічний розчин (контроль) і додають також, як в першу пробірку антиген. Пробірки обережно, щоб не змішати рідини, ставлять вертикально. При правильному нашаруванні преципітиногену на сироватку чітко позначається межа між двома шарами рідини. Постановка реакції обов'язково супроводжується контролями сироватки та антигену.
Облік. Результати реакції враховують в залежності від виду антигену і антитіл через 5-10 хв, 1-2 год або через 20-24 ч. У разі позитивної реакції в пробірці на кордоні між сироваткою і досліджуваним екстрактом з'являється преципитат у вигляді кільця білого кольору.
4. Визначення токсигенності коринебактерій дифтерії в реакції преципітації в агарі.
Ця здавна використовується реакція преципітації, запропонована для визначення токсичності коринебактерий дифтерії, ставиться на фосфатно-пептонном агарі в чашці Петрі. Уздовж її посередині поміщають смужку стерильної фільтрувального паперу, змоченою антитоксической сироваткою. Після підсушування на відстані 1 см від краю смужки бляшками діаметром 10 мм підсівають виділені культури. В одній чашці можна сіяти від 3 до 10 культур, одна з яких, контрольна, повинна бути свідомо токсигенной. Посіви поміщають в термостат.
Облік реакцій проводять через 24-48-72 ч. Якщо культура токсигенних, на деякій відстані від смужки паперу виникають лінії преципитата, що збігаються з лініями преципитата контрольної культури. Вони мають вигляд «стріл-вусиків», які добре видно в світлі.
ІМУНОЛОГІЧНІ РЕАКЦІЇ ВИЯВЛЕННЯ СПЕЦИФІЧНИХ АНТИТІЛ
5. Постановка непрямої реакції гемаглютинації (РНГА) виявлення титру специфічних антитіл у хворого.
В реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) в якості носія використовують еритроцити. Навантажені антигеном еритроцити склеюються в присутності специфічних антитіл до даного антигену і випадають в осад. Сенсибілізовані антигеном еритроцити використовують в РПГА як еритроцитарний діагностикум для виявлення антитіл (серодиагностика).
Постановка. У лунках полістиролових планшетів готують ряд послідовних розведень сироватки. У передостанню лунку вносять - 0,5 мл свідомо позитивної сироватки і в останню 0,5 мл фізіологічного розчину (контролі). Потім в усі лунки додають по 0,1 мл розведеного еритроцитарного диагностикума, струшують і поміщають в термостат на 2 ч.
Облік. У позитивному випадку еритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), в негативному - осідають у вигляді гудзики або колечка.
Мал. 6. Результат РНГА. Титр антитіл - 1: 100.
6. Постановка розгорнутої реакції аглютинації з метою виявлення титру специфічних антитіл у хворого.
Розгорнута РА для серодиагностики ставиться в сироватці хворих. Її розводять і фізіологічному розчині натрію хлориду від 1:50 - 1: 100 до 1: 800 або 1: 1600. Так як в більш низьких титрах сироватки можуть перебувати нормальні аглютиніни, наявні у здорових людей або хворих з іншим діагнозом (діагностичний титр). В якості антигену в цій реакції використовують діагностикуми - свідомо відомі суспензії, як правило, убитих бактерій, з якими безпечно працювати.
Ставлять реакцію наступним чином. У агглютінаціонние пробірки попередньо розливають по 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. В першу з них доливають 1 мл сироватки, розведеної 1: 100, і, змішавши її, 1 мл переносять у другу, з другої - в третю і т.д. В отримані дворазовий розведення сироваток (від 1: 100 до 1: 1600 і більше) вносять по 1-2 краплі суспензії бактерій, що містить 3 млрд мікробних тіл в 1 мл. Пробірки струшують і поміщають в термостат при 37 ° С на 2 години, потім добу витримують при кімнатній температурі.
Облік реакції розгорнутої аглютинації виробляють, оцінюючи послідовно кожну пробірку, починаючи з контрольних, при обережному струшуванні. У контрольних пробірках аглютинації не повинно бути. Інтенсивність реакції аглютинації відзначають наступними знаками: ++++ - повна аглютинація (пластівці агглютіната в абсолютній прозорої рідини); +++ - неповна аглютинація (пластівці в слабоопалесціює рідини); ++ - часткова аглютинація (пластівці чітко помітні, рідина злегка каламутна); + - слабка, сумнівна аглютинація - рідина дуже каламутна, пластівці в ній погано помітні; - - відсутність аглютинації (рідина рівномірно каламутна).
За титр сироватки приймають останнім її розведення. в якому інтенсивність аглютинації оцінюється не менше ніж два плюса (++)
