Полімеразна ланцюгова реакція
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - експериментальний метод біохімії, що дозволяє домогтися значного збільшення малих концентрацій певних фрагментовДНКв біологічному матеріалі.
Крім ампліфікації (збільшення числа копій) ДНК, ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з нуклеїновими кислотами (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК) і широко використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад, для діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), для встановлення батьківства, дляклонірованіягенов, виділення новихгенов.
На початку 1970-х годовнорвежскому ученомуХьеллю Клеппеіз лабораторії нобелівського лауреатаХара Гобіндом Хоранипрішла в голову думка, що можна ампліфікувати ДНК за допомогою пари коротких одноланцюгових молекул ДНК - сінтетіческіхпраймеров.
У той час ця ідея залишилася незатребуваною. Зате в 1983 році вона була успішно реалізована Кері МАЛЛІС.
Його метою було створення методу, який би дозволив ампліфіціроватьДНК в ході багаторазових последовательнихудвоенійісходной молекули ДНК за допомогою ферментаДНК-полімерази.
В основі методу ПЛР лежить природний процес - комплементарное добудовування ДНК матриці, здійснюване за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Ця реакція носить назву реплікації ДНК.
Природна реплікація ДНК включає в себе кілька стадій:
1) Денатурація ДНК (розплітання подвійної спіралі, розбіжність ниток ДНК);
2) Освіта коротких дволанцюжкових ділянок ДНК (запалів, необхідних для ініціації синтезу ДНК);
3) Синтез нового ланцюга ДНК (комплементарное добудовування обох ниток)
Кері Маллис довів, що даний процес можна застосувати для отримання копій коротких ділянок ДНК, специфічних для конкретного організму в, тобто здійснювати цілеспрямований пошук таких специфічних ділянок.
Щоб зробити денатурацію ДНК, її нагрівають.
На початку використання методу після кожного циклу нагрівання - охолодження доводилося додавати в реакційну суміш нову порцію ДНК-полімерази, так як вона швидко інактивована при високій температурі, необхідної для поділу ланцюгів спіралі ДНК. Процедура була дуже неефективною, вимагала багато часу і ферменту.
У 1986 годуметод полімеразної ланцюгової реакції був істотно покращено. Було запропоновано використовувати ДНК-полімерази з термофільних бактерій. Ці ферменти виявилися термостабільними і були здатні витримувати безліч циклів реакції.
Їх використання дозволило спростити і автоматизувати проведення ПЛР. Одна з перших термостабільних ДНК-полімерази була виділена з бактерій Thermus aquaticus і названа Taq -полімераза. Недолік цієї полімерази полягає в тому, що ймовірність внесення помилкового нуклеотиду у неї досить висока, так як у цього ферменту відсутні механізми виправлення помилок (3 '→ 5' екзонуклеазнаяактівность).
Полімерази Pfu і Pwo. виділені з архей, мають такий механізмом, їх використання значно зменшує число мутацій в ДНК, але швидкість їх роботи (процессівность) нижче, ніж уTaq. Зараз застосовують суміші Taq і Pfu. щоб домогтися одночасно високій швидкості полімеризації і високої точності копіювання.