Колонії недиференційованих ембріональних стовбурових клітин людини при збільшенні х 20
Метою такого клонування є отримання бластоцистов людини (порожнистих сферичних утворень, що складаються приблизно з 100 клітин), які містять внутрішню клітинну масу. Після вилучення з бластоцистов внутрішні клітини можуть розвиватися в культурі, перетворюючись в стовбурові клітини, які, в свою чергу, можуть перетворюватися в будь-диференційовані клітини людини: нервові, м'язові, кровотворні, клітини залоз і т.д.
Медичні застосування стовбурових клітин дуже перспективні і надзвичайно різноманітні. Вони можуть використовуватися, наприклад, для лікування цукрового діабету шляхом відновлення популяції загиблих або пошкоджених клітин підшлункової залози, що виробляють інсулін. Їх можна використовувати і для заміни нервових клітин при пошкодженнях головного або спинного мозку. При цьому не виникає небезпеки відторгнення трансплантатів та інших небажаних ускладнень, які супроводжують звичайні операції з пересадки клітин, тканин і органів.
Останнім часом термін «терапевтичне клонування» стали використовувати і для позначення клонування ембріонів, призначених для імплантації в матку жінки, яка потім може народити клонованого дитини. Це виправдовують тим, що таке клонування дозволить мати дітей безплідним парам. Однак воно не має відношення до лікування як такого. Тому більшість вчених, що займаються клонуванням в медичних цілях, вважають, що час «репродуктивного» клонування ще не настав - треба буде розв'язати ще безліч складних біологічних, медичних і етичних проблем.
Під клонуванням розуміють отримання ембріона або при заміні ядра яйцеклітини на ядро соматичної клітини, або шляхом партеногенезу, тобто при розподілі незаплідненою яйцеклітини. В обох випадках для клонування необхідні життєздатні яйцеклітини, які можуть бути отримані тільки від донорів.
Донорам робили спеціальні ін'єкції гормонів, щоб при овуляції виділялася не одна, а приблизно 10 яйцеклітин. Як джерела ядер для пересадки в яйцеклітини використовували фібробласти. Фібробласти отримували з біопсій шкіри анонімних донорів, серед яких були хворі на цукровий діабет, а також пацієнти з ушкодженнями спинного мозку. Після виділення фібробластів з них отримували культури клітин.
У перших експериментах були використані ядра фібробластів. Однак після пересадки ядра яйцеклітина хоч і починала ділитися, але процес швидко завершувався, і не утворювалося навіть двох роздільних клітин. Після низки невдач американські дослідники вирішили використовувати підхід Т.Вакаями і Р.Янагімачі (так званий гавайський метод), за допомогою якого була отримана перша клонована миша.
Цей метод полягає в тому, що замість ядра соматичної клітини (фибробласта) в яйцеклітину пересідає ціла оваріальна клітина. Оваріальні клітини забезпечують харчуванням розвивається яйцеклітину і настільки міцно з нею пов'язані, що зберігаються на її поверхні навіть після овуляції. Ці клітини настільки малі, що замість ядра можна використовувати цілу клітку.
Однак і в цьому випадку виникли значні труднощі. Знадобилося понад 70 експериментів, перш ніж вдалося отримати що ділиться яйцеклітину. З 8 яйцеклітин, в які були введені оваріальні клітини, дві утворили четирехклеточний ембріон, а одна - шестіклеточний. Після цього їх розподіл припинилося.
Партеногенетический підхід заснований на тому, що яйцеклітина стає гаплоидной не відразу, а на досить пізньому етапі дозрівання. Якби таку майже доспілу яйцеклітину вдалося активувати, тобто стимулювати до поділу, можна було б отримати бластоцист і стовбурові клітини. Недолік цього підходу полягає в тому, що отримані стовбурові клітини будуть генетично споріднені тільки донору яйцеклітини. Отримати стовбурові клітини для інших людей таким способом неможливо - обов'язково потрібно пересадка ядер в яйцеклітину.
Раніше були вдалі спроби активації яйцеклітин мишей і кроликів за допомогою різних речовин або електричного струму. Ще в 1983 р Е.Робертсон отримала стовбурові клітини з партеногенетичного ембріона миші і показала, що вони можуть формувати різні тканини, включаючи м'язову і нервову.
З людським ембріоном все виявилося складніше. З 22 яйцеклітин, активованих хімічним шляхом, тільки 6 утворили через п'ять днів щось схоже на бластоцист. Однак внутрішньої клітинної маси в цих бластоцисти не було ...
Існують три типи клонування ссавців: ембріональний клонування, клонування зрілої ДНК (репродуктивне клонування, метод Рослина) і терапевтичне (біомедичне) клонування.
При ембріональному клонування клітини, які утворюються в результаті поділу заплідненої яйцеклітини, поділяються і продовжують розвиватися в самостійні ембріони. Так можна отримувати монозиготних близнюків, трійні і т.д. аж до 8 ембріонів, що розвиваються в нормальне організми. Цей метод давно використовується для клонування тварин різних видів, але по відношенню до людини його застосовність досліджена недостатньо.
діаграма клонуванняКлонування ДНК складається в перенесенні ядра соматичної клітини в незапліднену яйцеклітину, з якої попередньо видалено її власне ядро. Така клітинна операція вперше була здійснена генетиком Г.Шпеманном в 1920-х рр.
Після видалення ядра яйцеклітину різними способами змушують перейти в стадію G0 клітинного циклу. В такому стані клітина знаходиться в спокої, що дуже важливо при підготовці її до пересадки нового ядра. Пересадка ядра здійснюється або шляхом трансплантації, як описано вище, або шляхом злиття яйцеклітини з іншого клітиною, що містить ядро.
У кожній лабораторії використовують свої модифікації цих загальних підходів. Найбільш відомий метод Рослина, за допомогою якого була отримана овечка Доллі.
Для успіху операції пересадки ядра важливо синхронізувати клітинні цикли клітин-донорів і яйцеклітини. Такий метод був розроблений і використаний І.Уілмутом і К.Кемпбеллом. Спочатку клітини-донори (при клонуванні овець - з вимені) поміщали в культуральне середовище, де вони починали ділитися. Потім вибирали одну з них і поміщали в обедненную середу, в результаті чого голодуюча клітина переходила в стадію G0 клітинного циклу. Після видалення ядра з яйцеклітини її відразу ж поміщали поруч з кліткою-донором, а через 1-8 год за допомогою електричного імпульсу викликали злиття клітин і активацію розвитку ембріона.
Однак лише деякі клітини виживають після такої процедури. Вижила клітку поміщали в яйцепровід вівці і дозволяли розвиватися приблизно 6 днів, після чого переносили в матку, де і тривало розвиток ембріона. Якщо все складалося вдало, в кінці кінців народжувалася клонована вівця - точна генетична копія вівці, від якої була взята клітина-донор.
Через великий ризик розвитку генетичних дефектів і раку проти використання цього методу для клонування людини виступають багато вчених і громадських діячів. У більшості країн репродуктивне клонування людини заборонено.
Вакаяма і Янагімучі змогли подолати ці труднощі і отримали клони миші навіть з великим виходом (3 з 100 спроб), ніж Уилмут (1 з 277 спроб). Вакаяма підійшов до проблеми синхронізації клітин інакше, ніж Уилмут. Клітини вимені, використані Уилмут, треба було штучно змушувати переходити в фазу G0. Вакаяма ж з самого початку використовував три типи клітин - клітини Сертолі, клітини головного мозку і оваріальні клітини, - які самі по собі або завжди знаходяться у фазі G0 (перші два типи клітин), або майже завжди в фазі G0 або G1. Крім того, донорські клітини використовували через кілька хвилин після виділення з тіла миші, а не містили в культурі.
Після видалення ядра з яйцеклітини в неї вводили ядро клітини-донора. Приблизно через 1 год клітина починала нормально функціонувати з новим ядром. Ще через 5 ч клітку поміщали в спеціальну середу, яка стимулювала клітинний розподіл на зразок того, як це відбувається при природному заплідненні. При цьому середовище містила спеціальну речовину - цітохалазін В, - яке запобігало розвиток полярних тілець. В результаті з яйцеклітини розвивався ембріон, який потім можна було пересадити в матку майбутньої матері.
Біомедичне клонування описано вище. Воно відрізняється від репродуктивного клонування тільки тим, що яйцеклітина з пересадженим ядром розвивається в штучному середовищі, потім з бластоциста видаляють стовбурові клітини, а сам пре-ембріон при цьому гине. Стовбурові клітини можуть бути використані для регенерації пошкоджених або відсутніх органів і тканин в дуже багатьох випадках, однак процедура їх отримання породжує безліч морально-етичних проблем, і в багатьох країнах законодавці обговорюють можливості заборони біомедичного клонування. Проте дослідження в цій області продовжуються, і тисячі невиліковно хворих (хворобами Паркінсона та Альцгеймера, діабет, розсіяний склероз, ревматоїдний артрит, рак, а також з травмами спинного мозку) з надією чекають їх позитивних результатів.