Гранзіми, сімейство серінових протеаз, експресуються виключно цитотоксическими Т-лімфоцитами і нормальними кілерами (NK), компонентами імунної системи, які захищають вищі організми від вірусної інфекції та клітинної трансформації. Після рецептор-опосередкованого контакту між гранзім-яка містить кліткою і інфікованої або трансформованому кліткою-мішенню, гранзіми вводяться в клітку-мішень шляхом ендоцитозу і викликають апоптоз. Гранзім B - найбільш потужний індуктор апоптозу з сімейства гранзіми. Подібно каспаза, цістеінового протеазам, які відіграють важливу роль у апоптозу, він може розщеплювати білки по кислотним залишкам, особливо аспарагінової кислоти. Інші гранзіми можуть виконувати додаткові функції, а деякі не можуть індукувати апоптоз. Гранзіми добре вивчені лише у людини і гризунів, і можуть бути об'єднані в три підродини по субстратної специфічності:
- гранзіми з ферментативної активністю, подібної хімотрипсину, які кодуються групою генів "локусу хімази";
- гранзіми з трипсин-подібної специфічністю, які кодуються "локусом триптази";
- і третє підродина розщеплює після нерозгалужених гідрофобних залишків, особливо метіоніну, і кодується "Met-ase-локусом".
Все гранзіми синтезуються як проферменти і, після відщеплення лідерних пептиду, і видаленням дипептида з N-кінця досягається максимальна ферментативна активність. Всі вони можуть блокуватися інгібіторами серинових протеази, і недавно була ідентифікована нова група інгібіторів - серпіни, деякі з яких специфічні для гранзіми. Майбутнє вивчення серпінов може прояснити, як клітини, що синтезують гранзіми, захищаються від апоптозу.
Генна організація і еволюція
"Ферменти гранул" або "гранзіми" [1] становлять близько 90% маси цитолитических гранул (спеціалізованих "секреторних" лізосом) цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTLs) і нормальних кілерів (NK). Гранзіми структурно близькі хімотрипсину, з тріадою ключових залишків - гістидин, аспарагінова кислота і серин в каталітичному центрі, і генетично пов'язані з іншими серинові протеазами лейкоцитів, особливо огрядних клітин і моноцитів. Всі вісім гранзіми (A-G і M) ідентифіковані у миші, але тільки п'ять відомі у людини (A, B, Н, М і тріптаза-2, також відома як granzyme 3). У людини невідомі еквіваленти мишачим гранзіми C-G, а гранзім Н характерний тільки для людини (Таблиця 1).
Всі гени гранзіми організовані подібним чином і їх транскрипти утворюються з п'яти екзонів, перший з яких кодує лідерних послідовність, тоді як Екзони 2, 3 і 5 кодують індивідуальні амінокислоти каталітичної тріади (Малюнок 1). Хоча більшість інших генів гранзіми кодують тільки один транскрипт, дві мРНК гранзіми А є результатом альтернативного сплайсингу різних екзонів 1.
Дослідження з картування генів свідчать, що три людських і мишачих підродини гранзіми співвідносяться з трьома відповідними місцями розташування, з кожним підродиною, які мають власну широку субстратне специфічність (Таблиця 2). Результати картування щурячих генів поки не надані. Гени, що кодують людський гранзім А (HFSP) і триптазу-2 (TRYP2) картіровани в хромосомі 5q11-q12 [2]. Гранзіми B і Н картіровани в кластері генів серінових протеаз в 14q11, який включає ген для протеази катепсини G, яка специфічна для мієлоїдних клітин [3]. Ген гранзіми М розташований поруч з генами, що кодують азуроцідін (AZU), еластазу нейтрофілів (NE) і протеїназу-3 (PR3) на хромосомі 19p13.3 [2,4]. У миші, відповідно, - хромосома 10 для гранзіми А та інших триптази, 14D (для гранзіми B-F) і 10C (для гранзіми М, AZU і NE).
В цілому, підродини гранзіми мають трипсин-подібну, хімотрипсин-подібну і еластаза-подібну специфічності, а їх гени згруповані в локусах "триптази", "хімази" і "Met-ase" відповідно (Таблиця 2) [4]. Ці кластери генів мають деякі особливості. Наприклад, у миші і людини гени гранзіми М, AZU і PR3 кожен має інтрон 1, розташований між залишками -7 і -6 лидерной послідовності, вказуючи на близькі еволюційні відносини. У людини гени, що кодують гранзіми B і Н і катепсини G тісно пов'язані, розташовуючись в межах 50 kb один від одного. Ген гранзіми Н розташований між двома іншими генами, і, можливо, виник як "гібрид", перших трьох екзонів і інтрони гена гранзіми B ген і кінцевої частини іншого гена серинових протеази. Поява гібрида могло бути отримано накопиченням точкових мутацій.
Мишачий, щурячий і людський гранзіми B містять близько 70% однакових амінокислотних залишків, в той час як гранзіми всередині будь-якого підродини (наприклад, гранзіми B і C у миші) подібні на 55-70%. Подібність амінокислотноїпослідовності знижується до приблизно 30-40% при порівнянні гранзіми з різних підродин, наприклад, гранзім А і гранзім B (37%), навіть в межах одного виду. Хоча гранзіми, ймовірно, є у різних видів, що мають розвинену імунною системою (наприклад, у птахів), зараз, на жаль, послідовності гранзіми визначені тільки у ссавців.
Як і у інших серинових протеаз, каталітична активність гранзіми визначається залишком серину в активному центрі, одним з тріади залишків His57, Asp102 і Ser195 в хімотрипсин [4]. Також вони мають оксіданіонний кишеню для стабілізації проміжних станів фермент-субстратного комплексу, і субстратсвязивающій кишеню, форма якого визначає специфічність протеази. Нещодавно була визначена кристалографічна структура щурячого гранзіми B [5]. Кристалічна структура піднесла кілька сюрпризів. Показано, що Субстратна щілину гранзіми У досить простора і цілих вісім залишків субстрату можуть тут розташовуватися. Ключовим залишком для контакту із залишком субстрату Р1 (амінокислоті, яка розташована біля розщеплюваного зв'язку в напрямку N-кінця, зазвичай аспарагінова кислота) є Arg226 (Малюнок 2).
Гранзіми синтезуються як проферменти, що дозрівають під час упаковки в цитолитические гранули. Після відщеплення лідируючого пептиду залишаються дві амінокислоти, з'єднані зі зрілою амінокислотною послідовністю, які пізніше вирізаються діпептіділпептідазой І (DPPI, також звана Катепсин C), пептідаза постійно експресується в лізосомах [6]. Гранзіми стають каталитически активними, тільки після відщеплення аміноконцевого дипептида; оптимум рН для гранзіми приблизно 7,5, тому вони максимально активні при вивільненні з секреторних гранул в цитоплазму (водневий показник 7). DPPI - ключовий регулятор функції гранзіми, і у DPPI-дефіцитні миші активність гранзіми низька або відсутня зовсім. Експресія незрілих гранзіми в клітинах, які відчувають нестачу DPPI призводить до утворення неактивного білка гранзіми. Гранзіми можуть експресуватися в таких клітинах, якщо активує дипептид видалений.
Гранзіми А і B забезпечені молекулами манозу-6-фосфату для упаковки манозу-6-фосфат-рецепторних шляхом [7], однаковим для гранзіми і людини, і гризунів. Менша частина гранзіми упаковується манозу-6-фосфат-незалежним шляхом. Гранзіми також піддаються непостійного N-кінцевому Глікозилювання. Мишачий гранзім C має кілька глікозильованих залишків, тоді як в іншому випадку, половина молекулярної маси гранзіми D доводиться на вуглеводи, включені в п'ять точок. Гранзіми схожі з іншими хімотрипсин-подібними ферментами але також і мають деякі особливості. Залишки в позиціях 1-4 (зазвичай Ile-Ile-Gly-Gly) і 9-16 високо консервативні в усіх гранзіми, і у людини, і у гризунів. Їх діпептідная послідовність зазвичай Gly-Glu або Glu-Glu. Вони мають три консервативні дисульфідні зв'язки, хоча гранзіми А і М і тріптаза-2 мають чотири. Гранзім А - єдиний гранзім який є димером завдяки міжмолекулярним дисульфідні містках.
Локалізація і функція
Експресія гранзіми обмежена активованими Т-лімфоцитами, незрілими Т-клітинами в тимусі (тімоцітамі), невеликий популяцією спеціалізованих Т-клеткок, в основному виявленої в кишечнику і нормальними кілерами. З них NK-клітини і Т-лімфоцити кишечника постійно продукують і накопичують гранзіми, тоді як в Т-лімфоцитах продукція мРНК і білкових ланцюгів гранзіми повинна бути індукована експозицією з антигеном або іншими типами стимуляції. Гранзіми експресуються більшістю CD8 + і меншою частиною CD4 + Т-клітин, сенсибілізованих in vitro антигеном або лектинами [8]. Ген гранзіми М експресується тільки в NK клітинах, тоді як інші гранзіми підродини, кодованого локусом Met-ase мають набагато більш широке поширення.
Гранзіми піддаються остаточній обробці DPPI при упаковці в цитотоксические гранули і зберігаються як активні ферменти, готові до введення при контакті з клітиною-мішенню. Гранули мають дві зони, видимі при ультраструктурному дослідженні. Кожна має щільний центральний стрижень, який містить гранзіми, гранули токсину перфорина і кислий протеогликан хондроїтину сульфат (CS). Чистий негативний заряд CS полегшує з'єднання з гранзіми, які є основними і позитивно зарядженими при рН гранули. Зовнішня зона кожної гранули має будову більш типове для звичайної лізосоми. Гранули розподілені випадковим чином в цитоплазмі, але вони швидко переміщаються в місце контакту з кліткою-мішенню при контакті, коли відбувається з'єднання, в процесі, відомому як поляризація.
Апоптотична функція гранзіми В
Основна функція гранзіми - це індукція загибелі інфікованих вірусом і інших потенційно небезпечних клітин. Вони досягають цього, використовуючи ключові субстрати в клітинах-мішенях перфорин-залежним шляхом. Перфорин-дефіцитні миші мають абсолютну безпідставність усіх гранзім-опосередкованих шляхів індукції клітинної загибелі та сприйнятливі і до різноманітних вірусів і до інших внутрішньоклітинних патогенів, таким як Listeria monocytogenes [9]. Гранзім B має найбільш високу апоптотичні активність з усіх гранзіми внаслідок його каспазоподобной здатності розщеплювати субстрати за ключовими залишкам аспарагінової кислоти. Але миші, дефіцитні по гранзіми B мають набагато більш м'яку імунну недостатність, ніж перфорин-дефецітние миші; передбачається, що є функціональна надмірності в гранзім-індукованому апоптозу. In vitro, гранзім CTLs B-дефіцитних мишей стимулюють фрагментацію ДНК в клітинах-мішенях значно повільніше ніж CTLs мишей дикого типу [10]. Інші гранзіми мають значно більш слабку апоптотичні активність, найкраще ілюструється гранзіми A, тріптаза, яка може посилювати гранзім-В-опосередковану загибель клітини. Гранзім А може стимулювати активацію каспаз набагато менш ефективно, ніж гранзім B, але надає інше проапоптотического дію внаслідок його здатності розщеплювати субстрати каспаз.
Здатність гранзіми В індукувати загибель клітини останнім часом вивчена детально. Гранзім B може розщеплювати, і отже активувати, кілька прокаспаз безпосередньо, також може прямо розщеплювати деякі субстрати каспаз, включаючи інгібітор активації каспаз DNase (ICAD). Це може впливати головним чином на фрагментацію ДНК в клітині-мішені. Надлишкової експресією антиапоптотического білка Bcl-2 в мітохондріях повністю відзначено зниження гранзім B, це вказує, що руйнування мітохондрій є необхідною деталлю гранзім-опосередкованої клітинної загибелі [11]. Нещодавно ми показали, що в людських і мишачих клітинах член проапоптотического сімейства Bcl-2 Bid швидко специфічно розщеплюється гранзіми В дистальніше аспарагінової кислоти в положенні 75, і укорочена молекула Bid вставляється в мітохондріальну мембрану щоб індукувати вивільнення іпроапоптична медіаторів, включаючи цитохром С і Smac / Diablo [12]. Крім каспаза-залежних механізмів є і каспаза-незалежні шляхи: клітини, в яких активність каспаз усунена, проте знищуються гранзіми. Хоча каспаза-незалежні механізми недостатньо вивчені, але ймовірно вони реалізуються через руйнування цитоскелета.
Неапоптотіческіе функції гранзіми
У гранзіми виявлений також ряд додаткових функцій, особливо для тріпсіноподобного гранзіми A, який може брати участь в регуляції проліферації В-лімфоцитів. Очищений мишачий гранзім А може надавати мітогенний ефект на В-лімфоцити за відсутності антигену і більш схожий на інші "триптази", такі як тромбін та трипсин. Гранзім A може розщеплювати ряд білків позаклітинного матриксу і тим самим полегшувати міграцію T і NK клітин в тканинах. Гранзіми можуть також індукувати секрецію цитокінів, безпосередньо активувати деякі цитокіни і таким чином посилювати деякі види запалення. Гранзім A може розщеплювати рецептори тромбіну після послідовності Leu-Asp-Pro-Arg щоб індукувати вивільнення інтерлейкінів IL-6 і IL-8 з моноцитів і ретракцію нейритів в олигодендроцитов. Роль гранзіми A і B в прямому контролі вірусної інфекції було виявлено у мишей з цілеспрямованим руйнуванням генів гранзіми A і B, в результаті чого миші проявили виражену чутливість до інфікування цитопатическим orthopox вірусом, ектромеліі. Незважаючи на це, гранзім A-дефіцитні миші здатні нормально відповідати на нецітопатіческій лімфоцитарний вірус хоріоменінгіту (LCMV) та внутрішньоклітинного бактеріальний патоген Listeria monocytogenes, і можуть усувати деякі сінгенние пухлини зі швидкістю, властивою звичайним тваринам.
Субстратна специфічність і інгібітори гранзіми
Гранзіми мають дуже високу субстратне специфічність, узгоджуються з їх роллю швидше обробляють, ніж руйнують, ферментів. Травні протеази, такі як трипсин, хімотрипсин і еластаза, мають дуже широке коло субстратів і амінокислотне оточення P1 залишку субстрату не так важливо, як у гранзіми, у яких більше 5 залишків, що є сусідами з P1 позицією можуть впливати на розпізнавання і розщеплення. Субстратна специфічність повністю визначена для гранзіми A і D і триптази-2 (всі вони є триптази; вони часто характеризуються по їх здатності розщеплювати Na-CBZ-L-лізину тіобензіловий ефір), для гранзіми B ( "Asp-ase", що розщеплює по аспарагінової кислоті і, можливо, по глутамінової кислоти), гранзіми M (також відомого як "Met-ase" і розщеплює по метионину) і гранзіми H (химазой). Гранзім B це серинові протеаза, характерна тільки для ссавців, яка діє на кислу сторону ланцюга [14], це необхідно для виконання функції іпроапоптична ензиму, який розщеплює Bid і прокаспази.
Різні синтетичні сполуки, включаючи пептид-тіобензіловий ефір, 7-аміно-4-метілкумарін і похідні паранітроаніліда (pNA) вивчалися, щоб визначити оптимальний субстрат і умови розщеплення для гранзіми. Оптимальними паранітроаніліднимі субстратами є D-Pro-Phe-Arg-pNA для мішаного гранзіми A і тозил-Gly-Pro-Arg-pNA для гранзіми A людини. Обидва гранзіми A инактивируются інгібіторами серинових протеаз, такими як діізопропілфлюорофосфат, фенілметілсульфонілфлюорід, безамідін, апротинін, лейпептін і інгібітор соєвого трипсину. Крім того, гранзіми A обох видів можуть бути блоковані поруч фізіологічних інгібіторів, такими як? 2-макроглобулин, антитромбін III і інгібітор C1-естерази, які можуть захищати навколишні тканини від побічних пошкоджень внаслідок дегрануляції [15]. Багато інгібітори гранзіми A інгібують гранзім B лише незначно. В одному великому дослідженні кращим інгібітором виявився людський інгібітор? 1-протеази, який викликає зниження активності гранзіми на 85%, якщо використовується в дозі 10 mg / ml [14].
Незважаючи на їх біологічне значення, гранзіми все ще відносно погано вивчені і багато важливих питань чекають своєї відповіді. Природа синергії між перфоріном і гранзіми - механізм, за яким гранзіми, потрапляють з ендосом в клітку-мішень поки недостатньо ясний. Каспаза-незалежні шляхи клітинної загибелі дуже важливі, тому що вони дозволяють CTLs знищувати клітини, у яких каспаз були заблоковані вірусними інгібіторами, такими як модифікатор цитокінової відповіді А (crmA), який синтезується poxvirides. Знову ж таки, природа цих шляхів поки не пояснена. Гранзіми, крім А і В, безсумнівно також мають багато функцій, не пов'язаних з апоптозом, і вивчення мишей, дефіцитних з того чи іншого гену гранзіми має пролити світло на цю область досліджень. Цікаво дізнатися більше про регуляції функцій гранзіми за допомогою нових серпінов. Ці дослідження можуть бути вельми значущими для наших уявлень про імунний гомеостаз (наприклад, регуляція числа CTL у відповідь на інфекцію), і у відповідь реакції на вірусну інфекцію і рак.