Мікроскопія забарвлених препаратів
Для виявлення вагінальних трихомонад мазки з матеріалом після фіксації можливо фарбувати різними способами, як простими - фарбування одним барвником, так і складними - фарбування декількома барвниками. Після фарбування мазки микроскопируют з використанням імерсійної системи мікроскопа і загальним збільшенням 500 - 1000 разів. Матеріал беруть з вогнищ ураження за допомогою стерильного зонда і наносять на чисте знежирене предметне скло рівномірним тонким шаром. Після висушування на повітрі, препарати фіксують протягом 3 - 5 хвилин в метиловий спирт, або етиловому 96% спирті, або в суміші Никифорова. Найбільш часто використовують такі способи забарвлення:
1. Фарбування за Романовським-Гімзою. Фіксований препарат поміщають в робочий розчин фарби (вихідний розчин фарби розведений дистильованою водою у співвідношенні 1:10) на 25 - 60 хвилин, потім його промивають водою, висушують і проводять мікроскопію з використанням імерсійної системи. Ядра трихомонад фарбуються в фіолетовий або фіолетово-рубіновий колір, протоплазма - в блакитний, блефаропласт, джгутики, аксостиль і хроматіновие зерна протоплазми фарбуються в рожевий або червоний колір;
2. Фарбування 1% водним розчином метиленового синього (1 г метиленового синього розчиняють в 100 мл дистильованої води, фільтрують через паперовий фільтр). На препарат наносять 1% розчин метиленового синього на 1 хвилину, потім ретельно змивають залишився барвник під струменем холодної води, висушують і проводять мікроскопію. Препарат синього кольору. Бактеріальна флора фарбується в синій колір різної інтенсивності. Вагінальні трихомонади різної форми розташовані в слизу, між клітинними елементами - чітко проглядається оболонка, ядро розташоване ексцентрично, інтенсивно забарвлене в синій колір, протоплазма ніжна, сітчаста, світло-синя, вакуолі безбарвні.
3. Фарбування 0.5% розчином брильянтового зеленого (0.5 г брильянтового зеленого розчиняють в 100 мл киплячої дистильованої води, фільтрують в гарячому вигляді через паперовий фільтр). На препарат наносять 0.5% водний розчин брильянтового зеленого на 1 хвилину, потім ретельно змивають барвник під струменем холодної водопровідної води, висушують і проводять мікроскопію. Препарат зеленого кольору - ядра клітин пофарбовані в зелений колір, протоплазма - в світло-синій. Слиз зеленого кольору. Бактеріальна флора забарвлюється в зелений колір різної інтенсивності. Вагінальні трихомонади розрізняють різної форми, вони розташовані між клітинними елементами в слизу, чітко проглядається оболонка, ядро інтенсивно забарвлене в зелений колір, розташоване ексцентрично, протоплазма сітчаста, світло-зеленого кольору, вакуолі безбарвні.
4. Фарбування за модифікованим способом Грама. Метод заснований на властивості вагінальних трихомонад і інших грамнегативнихмікроорганізмів при знебарвленні їх певний час в етиловому спирті, віддавати основний фіолетовий барвник і дофарбовував, в подальшому, додатковим оранжево-червоним.
- 1% водний розчин крісталлвіолета (1 г крісталлвіолета розчиняють в 100 мл киплячої дистильованої води, розчин фільтрують в гарячому вигляді через паперовий фільтр);
- водний люголевскім розчин (2 г йодистого калію розчиняють в 300 мл дистильованої води, в отриманому розчині розчиняють 1 г чистого йоду, фільтрують через паперовий фільтр;
- 96% етиловий спирт;
- 1% водний розчин нейтрального червоного (1 г нейтрального червоного розчиняють в 100 мл дистильованої води і фільтрують через паперовий фільтр.
Препарат покривають смужкою фільтрувального паперу і заливають її 1% розчином крісталлвіолета на 1 хвилину. Стежать, щоб між фільтрувальної папером і склом не було бульбашок повітря, їх видаляють, придавлюючи смужку змоченою крісталлвіолетом фільтрувального паперу скляною паличкою. Через 1 хвилину папір знімають, препарат промивають водопровідною водою і заливають розчином Люголя, який витримують протягом декількох секунд до почорніння мазка. Потім залишок люголевскім розчину змивають і приступають до знебарвлення препарату в 96% етиловому спирті. Знебарвлення проводять під контролем очі, по черзі занурюючи і виймаючи препарат зі спирту, що знаходиться в стаканчику. Знебарвлюють препарат доти, поки з його тонких ділянок перестануть стікати фіолетові струмені барвника і вони стануть блідо-сірого кольору. Препарат швидко промивають під струменем водопровідної води, а потім дофарбовують протягом 3 хвилин 1% водним розчином нейтрального червоного. Препарат ретельно промивають, поки струмінь води, що стікає з нього, не стане прозорою, висушують і проводять мікроскопію. При правильному фарбуванні препарат оранжево-червоного кольору на тонких ділянках, лілово-фіолетового на товстих. Ядра клітинних елементів (лейкоцитів, епітеліальних клітин) частково утримують основну фіолетове забарвлення, тобто в центрі вони повинні бути пофарбовані у фіолетовий колір, по периферії в оранжево-червоний. Висока якість забарвлення забезпечується своєчасним припиненням знебарвлення препарату.
Вагінальні трихомонади фарбуються блідо - оболонка у вигляді тонкої смужки оточує сітчасту протоплазму оранжево-червоного кольору, ядро бузкового або фіолетового кольору, джгутики і ундулирующая мембрана не проглядається. Позитивна відповідь потрібно давати при виявленні тільки типових форм вагінальних трихомонад. При виявленні змінених (округлі, нетипово-забарвлені і ін.), Але схожих на вагінальних трихомонад найпростіших, треба досліджувати повторно взятий матеріал або зробити посів на поживні середовища.
Мікроскопія забарвлених препаратів є простим, дешевим і доступним методом, що не вимагає негайного проведення дослідження та спеціального обладнання. Однак він має низьку чутливість і специфічність.
культуральний метод
Культуральний метод найбільш чутливий і специфічний. Вагінальні трихомонади дають хороший зростання на штучних поживних середовищах за умови дотримання правил забору матеріалу для дослідження і його культивування. Живильні середовища повинні містити антибіотики для придушення росту супутньої мікрофлори. Вагінальні трихомонади - факультативні анаероби. Оптимум їх зростання в слабокислою середовищі при середньому рН 5.8 - 6.3 і + 37 ° С, тому перед посівом культуральне середовище слід прогріти, якщо вона зберігалася в холодильнику. Слід уникати перегріву культури вище 37-38 ° С, тому що підвищення температури вагінальні трихомонади переносять гірше, ніж зниження. Матеріал для дослідження з осередків ураження слід брати стерильним зондом або бактеріальної петлею. Матеріалом для дослідження можуть служити Центрифугат змивів стерильним фізіологічним розчином, які вносять в культуральне середовище стерильною пастерівською піпеткою. Стерильною пастерівською піпеткою слід користуватися при пересеве виділених штамів.
При вирощуванні на рідких поживних середовищах вагінальні трихомонади дають придонний зростання у вигляді щільного білуватого осаду, з якого пастерівської піпеткою беруть матеріал для дослідження в нативному препараті. Мікроскопічне дослідження культур і ідентифікацію слід проводити на 3 - 5-й день, при негативних результатах на 7 - 9-й і на 11 - 17-й день після посіву, тому що тривалість циклу розвитку вагінальних трихомонад в культурі залежить від величини посівної зони. З придонного зростання готують нативний препарат одним з описаних вище способів і проводять мікроскопію з об'єктивом 40 або 90, окуляр 7 або 10. Піхвові трихомонади в поле зору можуть бути поодинокими або великими скупченнями, активно рухаються, при цьому добре проглядається рух джгутиків і ундулирующей мембрани. Можливо визначати вагінальні трихомонади в культурі методом РНІФ (реакція непрямої імунофлюоресценції).
Культуральний метод тривалий за часом, вимагає дорогих середовищ.
імунологічний метод
Імунологічний метод дозволяє визначити специфічний поверхневий антиген вагінальної трихомонади реакцією непрямої імунофлюоресценції (РНІФ) за допомогою набору "ТріхоСлайд". Матеріалом для дослідження служать мазки-відбитки з осередків ураження, які наносять на чисте знежирене предметне деколірованное (зі спеціальною лункою) скло стерильними одноразовими зондами, мають ватний тампон з підвищеними сорбційними властивостями. При нанесенні матеріалу тампоном багаторазово торкаються поверхні предметного скла. Після висихання на повітрі препарат фіксують 5 хвилин 96% етиловим спиртом або ацетоном (наносять на препарат кілька крапель безводного ацетону до повного його випаровування). Фіксовані препарати краще не зберігати, тому що при зберіганні вагінальні трихомонади руйнуються, що може утруднити постановку правильного діагнозу. Після фіксації проводять "фарбування" препарату, яке має два етапи. На першому етапі на препарат наносять 30 мкл реагенту №1- специфічні протівотріхомонадние АТ - і інкубують його у вологій камері (уникати підсихання реактиву) при кімнатній температурі або 37 ° С 15 хвилин. Потім препарат промивають дистильованою водою 30 секунд, висушують на повітрі і наносять 30 мкл реактиву №2 - антитіла до протівотріхомонадним АТ, мічені Фітц - инкубируют 15 хвилин у вологій камері при кімнатній температурі або 37 ° С. Після цього препарат промивають 30 секунд дистильованою водою, висушують на повітрі і проводять мікроскопію в люмінісцентні мікроскопі з використанням масляній або водній імерсійної системи. Препарати до мікроскопії готують також, як і при діагностиці хламідіозу методом РІФ.
Трихомонади виявляються у вигляді поліморфних мембраноограніченних структур, що мають яскраво-зелене свічення. У рухливих форм можуть фарбує джгутики. Неспецифічна бактеріальна флора забарвлюється в помаранчевий колір, клітини епітелію, лейкоцити, сперматозоїди забарвлюються в оранжевий і червоно-бурий кольори. Допускається неспецифічне дифузне слабо-зелене свічення цитоплазми епітеліальних клітин, слизу і сторонньої мікрофлори. Результат вважають негативним, якщо в мазку відсутня специфічне світіння при обов'язковій наявності не менше 10 клітинних елементів.
Метод РНИФ має високу чутливість і специфічність, порівнянної з культуральним методом, дозволяє виявляти нежиттєздатні форми збудника, не можуть бути визначені культуральним методом. На відміну від нативних препаратів, він дозволяє виявити атипові і нерухомі форми вагінальних трихомонад. Це підвищує його діагностичну значимість. Метод РНИФ порівняно дешевий, простий у виконанні, не вимагає спеціального устаткування, дозволяє візуально контролювати якість взяття матеріалу і отримати відповідь протягом 40 - 60 хвилин. Все це робить його методом вибору для діагностики урогенітального трихомоніазу.
Остаточне встановлення діагнозу захворювання можливо при виявленні збудника або наявності антитіл у виділеннях з вогнищ ураження або в крові пацієнта методами мікроскопічного, бактеріологічного, а також імунологічного (серологічного) досліджень.