1. Загальні положення
1.1. Псевдомоноз - інфекційна хвороба тепловодних, холодноводних і акваріумних риб. зустрічається в ставкових та індустріальних господарствах.
1.2. Збудниками псевдомоноза є хвороботворні штами бактерій роду Pseudomonas. Найчастіше зустрічаються види Ps.fluorescens, Ps.putida, Ps.aureofaciens, Ps.cyprinisepticum, Ps.intestinalis, Ps.anguilliseptica, Ps.chlororaphis. Кожен з цих видів може викликати захворювання самостійно, в асоціації один з одним або іншими мікроорганізмами.
1.3. Для бактеріологічного дослідження беруть тільки живу хвору рибу. У кожному разі досліджують не менше 5 примірників риб з ознаками хвороби.
2. Бактеріологічне дослідження
2.1. Висіву виробляють з асцитної рідини, печінки, нирок, селезінки, з крові (окремо з кожної проби) на чашки з МПА (рН 7,2-7,4).
2.2. Захворювання характеризується септичним перебігом, тому в посівах з крові і паренхіматозних органів, як правило, рясний ріст культури збудника.
2.3. Посів можна проводити інокуляціонной петлею, занурюючи її в обстежуваний орган і повертаючи кілька разів, або пінцетом з вигнутими браншамі.
2.4. Посіви інкубують при 25-26 ° С протягом 48-72 годин. На МПА бактерії роду Psudomonas утворюють безбарвні або сірувато-білі напівпрозорі, круглі опуклі колонії з рівними краями. На 3-4-у добу відзначають освіту жовто-зеленого або оранжево-жовтого флюоресцирующего пігменту. Ps.cyprinisepticum і деякі штами Ps.fluorescens можуть утворювати слизові колонії.
2.5. При виявленні на агарі характерного зростання підозрілі колонії пересівають на середовище Кліглера і через 18 годин культури, що дали на цьому середовищі лужну реакцію (стовпчик і скошена поверхня забарвлюється в малиновий колір), піддають подальшому вивченню. Для диференціації збудників роду Pseudomonas від бактерій схожих з ними пологів (табл. 1) визначають оксидазную активність, здатність розщеплювати глюкозу в середовищі Хью-Лейфсона (тест окислення-ферментації).
2.5.1. Для визначення оксидазної активності на невелику ділянку скошеної поверхні з культурою наносять краплю суміші реактивів 1% -ного водного розчину діметілпарафенілендіаміна (гідрохлориду або оксалату) і 1% -ного розчину (а-нафтол та 60 ° спирті-ректифікаті. Оксидазопозитивних колонії забарвлюються в синій колір через 30-60 секунд. Оксідазоотріцательние культури далі не досліджуються.
2.5.2. При проведенні тесту окислення-ферментації (О / Ф) досліджувану культуру засівають уколом до дна в пробірку з 6 мл середовища Хью-Лейфсона. Посіви інкубують 96 годин при 25-26 ° С. Збудники псевдомоноза окислюють глюкозу в аеробних умовах, тому середовище в верхніх шарах стає солом'яно-жовтої, нижній шар залишається без зміни ферментація не відбувається.
2.5.3. У разі сумнівного результату тесту окислення-ферментації проводять додаткові дослідження декарбоксілазной активності виділених культур. Досліджувану культуру висівають в чотири пробірки з середовищем Меллера або Біргер-Крушінскоі, в три з яких додано по одній з амінокислот (аргінін, лізин, орнітин), четверта - контрольна. Потім на поверхню середовища нашаровується стерильне вазелінове масло (приблизно I мл). Посіви інкубують 4 діб при 25-26 ° С. Збудники псевдомоноза мають аргінін-дегідролазой, але не декарбоксилируется лізин і орнітин, в результаті чого колір середовища Біргер-Крушинської в пробірці з аргініном стає синім. Колір середовища Меллера змінюється до фіолетового, при слабкій реакції стає блакитно-сірим.
2.5.4. Для визначення видової приналежності культур проводять висіву на середовища Гіссен з манітом, сахарозою, мальтозою, лактозою (див. Табл. 2).
2.5.5. Рухливість культури визначають при посіві на середу Хью-Лейфсона. Рухливі культури ростуть ліффузно, викликаючи помутніння всього середовища, нерухомі - строго по уколу (Ps.fluorescenc f. Capsulata).
3. Біологічне дослідження
3.1. Біологічну пробу ставлять на 6-10 клінічно здорових риб того ж виду і віку, від яких виділена культура збудника, завезених з господарства, благополучного по даному захворюванню.
3.2. Дводобовий бульонную культуру вводять 4-6 рибам внутрішньом'язово і 4-6 рибам внутрішньочеревно в дозі 0,3 мл. Рибам масою понад 150 г вводять по 0,5 мл культури. Температура води в акваріумі, де міститься заражена риба, повинна бути в межах 15-25 ° С.
3.3. Одночасно ставлять контроль на 6-10 риб, яким вводять стерильний МПБ в тих же дозах. Термін спостереження 16 діб.
3.4. У разі прояву захворювання або загибелі риб проводять бактеріологічне дослідження.
3.5. Біологічну пробу вважають позитивною, якщо всі заражені риби хворіють і не менше 50% з них гине з ознаками псевдомоноза, а з крові і внутрішніх органів реізоліруют вихідну культуру.
3.6. Лабораторний діагноз на псевдомоноз вважають встановленим при виділенні культури з властивостями, характерними для збудників хвороби, і патогенної для піддослідних риб.
З твердженням цих Методичних вказівок втрачають силу "Методичні вказівки з лабораторної діагностики Псевдомоноз риб", затверджені ГУВ Держагропрому СРСР 12.06.1986 р
Додаток 1
Таблиця 1Діфференціація бактерій роду Pseudomonas від бактерій схожих з ними пологів