ОСОБЛИВОСТІ мікологічної ДІАГНОСТИКИ
Оніхомікоз - ПОГЛЯД клініцистів.
Роль мікологічної діагностики при оніхомікозі важко переоцінити, особливо з урахуванням зростання числа рефрактерних дерматомікозів, які потрібно часто міцеліальними недерматоміцетамі. Добре відомо, що оніхомікоз можна діагностувати, грунтуючись тільки на клінічних ознаках. За повідомленням Staats C і Korstanje M. микологическое підтвердження при клінічно запідозреним оніхомікозі було отримано тільки в 60% випадків дослідження матеріалу нігтів кисті і 45% - нігтів стоп репрезентативної вибірки пацієнтів 18.
У деяких вітчизняних "референтних" лабораторіях в більшості випадків не ростуть навіть дерматофіти - при повторних позитивних результатах прямий мікроскопії, чутливість культурального методу не перевищує 25%. Серед лабораторних мікологів немає ясного розуміння практичного використання селективних середовищ в диференціальної діагностики онихомикоза. Як насправді працює циклогексимид (актідіон), які існують нюанси, важливі особливості - немає відпрацьованої алгоритміки, впевненості дослідника.
Відомий мікології GuptaA згадує про постулатах Коха, як про важливу відправної точки діагностики інфекцій нігтів. Однак сам Кох, як відомо, значно видозмінив власні постулати, зіткнувшись з реаліями клінічної епідеміології. Постулати Коха (постулати Коха-Пастера) - ряд тверджень, які можна зробити щодо мікроорганізму, з яких випливає, що останній є збудником якоїсь хвороби:
Мікроорганізм постійно зустрічається в організмі хворих людей (або тварин) і відсутній у здорових;
Мікроорганізм повинен бути ізольований від ураженого тваринного і його штам повинен бути вирощений в чистій культурі;
При взаємодії з препаратом (культурою) мікроорганізму, здорова людина (або тварина) захворює;
Мікроорганізм повинен бути повторно ізольований від експериментально зараженого тваринного.
Зауважимо, однак, що Кох повністю вилучив другу частину першого постулату, виявивши безсимптомних носіїв холери (Koch, 1893) і пізніше - тифу.
Третій постулат не завжди має місце, як це виявив сам Кох у туберкульозу та холери (Koch, 1884). Дійсно, сьогодні можна констатувати, що індивіди, позбавлені гена CCR5 Δ32, як прийнято вважати, стійки до ВІЛ-інфекції.
В цілому, постулати Коха донині все ж не втратили своєї значущості і залишаються основними принципами мікробіології і інфектології, відповідність яким є необхідною умовою обґрунтування гіпотези інфекційної етіології якого-небудь захворювання.
1) контоменантами (зростання в лабораторних умовах з неактивних щодо нігтя суперечка / конідій, випадкова знахідка, артефакт). Контамінація за відсутності доказів патогенності гриба може вказувати також на недотримання регламенту дослідницької методики (неякісний забір матеріалу, порушення умов його доставки, забрудненість лабораторії і т.п.)
2) комменсали шкіри в нормі
3) Транзитна Сапробная колонізація (колонізація без інвазії)
4) Персистирующая вторинна колонізація (тільки на тлі поразки дерматоміцетами, що не підтримується по елімінації останніх) *
5) Вторинна інвазія (викликають ураження нігтя за умови попереднього пошкодження тканинного бар'єру первинним патогеном, травмою, при врослому нігті, неінфекційної ониходистрофии)
6) Первинна інвазія (досить вірулентні гриби, здатні інфікувати і викликати оніхомікоз, здорового, неколонізірованного перш нігтя
Результати дослідження не можуть бути визнані достовірними, якщо на момент взяття матеріалу не минув щонайменше 4 (краще - 8-12) тижнів після припинення системної і місцевої антифунгальной терапії. При проведенні великих досліджень конроль вилікування здійснюється кожні 2 місяці протягом року. Слід зазначити, що після курсу лікування антимикотиками нерідко відсутній ріст грибів в культурі поряд з виявленням міцелію мікроскопічно. Слід пам'ятати, що грибкова інфекція поширюється як лісова пожежа, тому активні життєздатні гіфи сконцентровані і можуть бути легко виявлені в області "передового краю" інфекції. Для отримання адекватних результатів мікологічного дослідження матеріал слід брати не з поверхні, а з глибших і проксимальних (при дистально-латеральної формі) областей ураження (за винятком хіба що ізольованого поверхневого ураження при поверхневому білому оніхомікозі), при Candida оніхомікозі - в більшості випадків в області проксимального / латерального краю нігтя. При Оніхоліз матеріал повинен бути взятий з-під нігтьової пластинки. Gupta A. Ryder J і Summerbell R резонно вважають, що діагноз кандидозного онихомикоза не може бути поставлений без виявлення псевдомицелия Candida в матеріалі нігтя 49.
Доставка матеріалу в лабораторію повинна здійснюватися в стерильному одноразовому контейнері, а не у випадковому листку паперу. Контейнер повинен бути герметично закритий. Матеріал не повинен бути занадто вологим, щоб уникнути швидкого зростання бактеріальних і грибкових контамінантів, що ускладнює або робить неможливим діагностику. Зразки повинні бути в роботі не більше ніж в тижневий термін після взяття. Чутливість мікроскопії суттєво підвищує застосування флюоресцентних барвників, наприклад, калькофлуора білого. Для виділення патогенних грибів використовують різні середовища. Дерматоміцети ізолюють на селективних середовищах, що містять зазвичай циклогексимид, гнітючий зростання більшості бактерій і цвілевих грибів, наприклад, MycoselTM. Інші середовища вільні від циклогексаміду, що дозволяє виділяти і патогенні цвілеві гриби (агар Сабуро, середа Літтмана, картопляний агар з глюкозою). Для виключення бактеріальної контамінації в середовища зазвичай додають гентаміцин або хлорамфенікол. Бактеріальні інфекції нігтя визначають за допомогою універсальних неселективних середовищ. Референтних лабораторій обов'язково повинні проводити посів матеріалу і на середу з циклогексимідом, і на середу без нього, оскільки етіологічнезначення цвілевих грибів все більше зростає. Антибіотичні субстанції, які продукують дерматоміцетами in vivo. можуть призводити до виникнення в області поразки антибіотикорезистентних популяцій бактерій, наприклад Staphylococcusaureus. Інгібування таких бактеріальних ізолятів може бути важко. Найбільш часто асоційований з ними T.rubrum. Наявність таких бактерій нерідко блокує пігментообразованія грибів, що може призводити до помилки їх ідентифікації 51,52. Для селективного виділення цвілевих грибів з виключенням дерматоміцетів нерідко використовують середу Чапека, що містить сахарозу і нітрат, на якій дерматоміцети не ростуть. Більш суворим підтвердженням дійсної інвазії патогенного недерматоміцета є неодноразове послідовне виділення гриба в культурі з ураженого нігтя за умови такої ж серії негативних культуральних досліджень на дерматоміцети. Мікст-інфекція дерматофитов і цвілевих грибів зустрічається, за деякими даними, в половині всіх випадків виявлення цвілеві онихомикоза
Позитивні результати мікроскопії та культурального дослідження за відсутності ясних клінічних ознак оніхомікозу можуть розглядатися як свідчення контамінації або непатогенної колонізації, за винятком, в більшості випадків, дерматоміцетів. У таких сумнівних випадках слід вдатися до гістологічного дослідження.
Гістологічний метод діагностики не схильний до ризику контамінації та набагато швидше, ніж культуральний метод, об'єктивно демонструє реальну інвазивність / вірулентність збудника, чутливий навіть на тлі лікування антимикотиками. на відміну від прямої мікроскопії і, особливо, ПЛР Herbst R. Brinkmeier T. Frosch P.
Найбільш вигідна у фінансовому відношенні (співвідношення чутливість / вартість забарвлення хлоразолом чорним (chlorazol black E).
Будучи найбільш чутливим методом діагностики онихомикоза, гістологічне дослідження дозволяє також ясно побачити активний характер інвазії гриба в апарат нігтя, відмінний від випадкової контамінації або транзиторної колонізації, розрізняти морфологічні елементи гриба 62.
Отже, при оніходістрофія сумнівного генезу за гістологічною картиною серійних зрізів можна однозначно відрізнити інвазивний характер поразки від простої колонізації подногтевого матеріалу. Родова і видова ідентифікація міцеліальних грибів, однак, зазвичай неможлива. У ряді випадків досвідчений лікар-лаборант по ряду характерних особливостей може скласти припущення про видову приналежність гриба, наприклад, спорулирующих (переважно в тріщинах і порожнечах нігтя) Scopulariopsis brevicaulis - завдяки характерній формі конідій, що нагадують лимон, або філаментів Scytalidium spp. - по особливого виду товстим гіаліновим клітинних стінок. Для Fusarium spp. так само як і для Aspergillus spp. характерно розгалуження міцелію під гострим кутом.
Слід підкреслити той факт, що при ПЛР отримані результати в ряді випадків є хибнопозитивними клінічно. оскільки може бути детектувати ДНК і нежиттєздатних гіф міцеліальних грибів або міцеліальних форм дріжджоподібних грибів, або ж може бути визначено наявність ДНК брунькуються дріжджоподібних грибів за відсутності активного інвазивного міцелію. Життєздатні елементи гриба можуть бути характерно візуалізовані за допомогою методів вітальної забарвлення, наприклад, нейтральним червоним або певними флуорохромами, наприклад, діацетат флюоросцеіна, істотно що абсорбується тільки активними клітинами гриба.
Отже, очевидно, що орієнтація тільки на дані ПЛР (в тому числі мультиплексной ПЛР, пандерматоміцетной ПЛР), особливо - чутливої і високоспецифічний гніздовий (зі вкладеної парою праймерів) ПЛР, в ряді випадків не може бути виправдана клінічно. Результати ПЛР не можуть розглядатися в якості самостійного діагностичного критерію, так само як і критерію невиліковності при позитивному результаті - за відсутності культурального і мікроскопічного підтвердження.
Вважаємо, що для вирішення всіх непорозумінь і визначення істинної етіопатогенетичної ролі недерматоміцетов слід провести дослідження, подібне виконаному в Лозанні групою Monod. але доповнити його панч-біопсією з наступним гістологічним / гістохімічним дослідженням. Інакше в проблемі не розібратися ще досить довго.
Monod M. також порівнює ПЛР і культуральний метод за показником вартість / ефективність: вчетверо дешевший, культуральний метод дає 40% помилково негативні результати 17.
Очевидно, що найважливішим завданням є розробка методів швидкої, недорогий, легко відтворюється ідентифікації всіх грибкових патогенів та швидких, недорогих тестів для визначення вірулентності і резистентності до антімікотікам виділених в конкретному випадку збудників.
Необхідно чітко визначити межі репрезентативності тих чи інших діагностичних тестів, в тому числі щодо оцінки контамінації, виробити суворі алгоритми комбінації діагностичних досліджень і проведення повторних тестів.
Академічна дерматологічна школа за традицією досить різко відкидає саму можливість первинного ураження нігтів дріжджоподібними грибами. Однак, результати незалежних досліджень, проведених в наших же широтах, не суперечать такої можливості. На нашу думку, для більш точного з'ясування справжніх патогенних потенцій дріжджоподібних і ряду цвілевих грибів слід неухильно дотримуватися відомими критеріями діагностики. Наступні критерії дозволять припинити безплідні дискусії про можливу контамінації і умовної патогенності, кордони якої не визначені скільки-небудь ясно:
(1) підтвердження не тільки прямий мікроскопії, але гістологічним дослідженням, єдино здатним показати справжні вірулентні потенції гриба
(2) культуральная і генетична (ПЛР) детекция в серійних, правильно взятих зразках
(3) негативний результат повторних досліджень на присутність в патологічному матеріалі дерматоміцетів *
(4) ясні клінічні ознаки і особливості інфекції
(5) контрольні дослідження групи здорових осіб (уявлення про характер і рівні контамінації в даному регіоні)
(6) оцінка можливих механізмів інвазії (наприклад, динамічне визначення експресії генів кератінолітіческой ензимів)
* Питання лабораторної та клінічної оцінки мікст-інфекцій при онихомикозах розроблені мало, тому критерій відсутності виявлення дерматоміцетів (також в серійному дослідженні) для підтвердження недерматоміцетной природи ураження на даному етапі представляється правильним.
Звісно ж, що тільки таким чином можна отримати статистично достовірні епідеміологічні дані для даного регіону і далі орієнтуватися на них при оцінці кожного конкретного діагностичного випадку.
Важливе завдання подальших досліджень етіопатогенезу онихомикоза - вивчення функціональної біології грибів invivo без відриву від важливих, ключових для розвитку і підтримки інфекційного процесу особливостей анатомії, фізіології і біохімії нігтя як мозаїчної морфофункциональной системи. Очевидно, що етіологічні відмінності різних клінічних типів ураження припускають існування в нігті відмінних фізіологічних / біологічних ніш для розвитку грибкової інфекції. Вважаємо також, що одним із завдань наукового пошуку має бути визначення інших, ніж кератин, джерел живлення грибів. Відмінності ферментних систем і прікрепітельних властивостей грибів можуть бути ключем до розуміння особливостей епідеміології та етіопатогенезу онихомикоза. З іншого боку, пильна увага слід приділити вивченню тонких генетичних, імунологічних і метаболічних особливостей організму-господаря, які передбачають підвищену схильність до інфікування.
Також слід зазначити, що незважаючи на численні дослідження, не проведене цілком певної родової і видовий диверсифікації патогенів при оніхомікозі стопи versus оніхомікозі кисті. Необхідні глибокі дослідження, чітко і недвозначно встановили б справжні чинники патогенності і вірулентності дріжджоподібних і пліснявих грибів при оніхомікозі - відносно простими, відтвореними методиками.
Отже, можна резюмувати, що в клінічній епідеміології оніхомікозу в даний час спостерігається хвороблива зміна самої науково-методологічної парадигми, клініко-діагностичної ідеології практичної мікології - на тлі виразно підсилюються патогенних властивостей недерматоміцетов відбувається і науково-технічна революція засобів діагностики. Консервативний погляд на оніхомікоз як вотчину безроздільно панують дерматоміцетів поступово змінюється на більш зважений, конструктивний підхід, який визначається принципами доказової медицини 69. а не медицини шкіл і думок.
Однак і саме проведення великих рандомізованих контрольованих досліджень, (підстави медицини доказової) з даної проблематики досить важко через чи можливої практично суворої стандартизації діагностичних методів і критеріїв оцінки нерідко антіномічних даних, отриманих різними методами (пряма мікроскопія, культуральне дослідження, ПЛР) - в епоху зміни наукової парадигми в практичній мікології.